野木瓜多糖中蛋白質含量測定方法的研究

野木瓜多糖中蛋白質含量測定方法的研究

野生黃瓜是貴州省遵義正安縣獨特的野生自然資源。它是薔薇科和秋海棠灌木的一種附著。正安縣野木瓜品質獨具特色,具有果大、皮薄、肉厚、肉質細嫩、味甘酸、氣香等特點。木瓜在中醫(yī)藥學中用途廣泛,《中醫(yī)大辭典》、《本草綱目》、《本草拾遺》等著名醫(yī)著都記載了木瓜具有舒筋活絡,解渴生津、平肝和胃、祛風除濕等功效,能治療腰膝疼痛,腳氣水腫,痢疾霍亂,心痛腹痛等疾病,另外,還有鎮(zhèn)咳、清暑利尿、解酒祛痰等作用?，F(xiàn)代研究表明,野木瓜含有豐富的有機酸、果膠、蛋白質、多種氨基酸、多種維生素和多種礦物質。多糖是野木瓜中有效成分之一,野木瓜粗多糖中含有多種雜質,影響其多糖純度最主要的物質為雜蛋白。如何快速,簡單,準確地對其中的蛋白質含量進行檢出,無疑將直接影響著野木瓜多糖的純化效率和開發(fā)應用。蛋白質作為一項質量和資源評價的重要指標,其含量必需明確,故探索測定野木瓜多糖的蛋白質含量方法有重要的意義。目前關于野木瓜多糖中蛋白質含量的測定方法還鮮有報道,本實驗采用考馬斯亮藍G-250染色法對野木瓜多糖中蛋白質含量進行測定,與其它方法相比,該法簡單、迅速,且相對較為準確,是測定野木瓜多糖中蛋白質含量的有效方法。1主要材料、設備和原則1.1實驗試劑和試劑野木瓜:貴州遵義天樓野木瓜有限公司提供;野木瓜多糖:本實驗室自制;牛血清白蛋白:進口分裝,Sigma公司;考馬斯亮藍G-250:進口分裝,中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。1.2儀器、儀器和儀器HH·SH-Z型電熱恒溫水浴鍋:北京長安科學儀器廠;ZK-828型電熱真空干燥箱:上海躍進醫(yī)療器械廠;DWF-180型電動植物粉碎機:河北省黃驊市科研器材廠;SL2000電子天平:澳豪斯公司;UV2550紫外可見分光光度計:島津公司;N-1000V-WB旋轉蒸發(fā)儀:日本東京理化器械株式會社;DL-5型離心機:上海安亭科學儀器廠。1.3蛋白質含量測定蛋白質分子均具有酰胺基團,棕紅色的考馬斯亮蘭G-250染料上的陰離子與蛋白質的酰胺結合,使溶液變?yōu)樗{色,其最大吸收峰也由465nm變?yōu)?95nm,蛋白質在1μg~1000μg范圍內(nèi),蛋白質與色素物質結合物在595nm波長下的吸光度與蛋白質含量成正比,故可用于測定蛋白質含量。2方法2.1蛋白質標準液的制備精確稱取牛血清白蛋白10.00mg,用少量蒸餾水溶解定容至100mL,即為0.1mg/mL蛋白質標準液,4℃~5℃冰箱中保存。2.2試劑制備考馬斯亮藍g-200精密稱取考馬斯亮藍G-250100.00mg加入95%乙醇50mL,再加入85%磷酸100mL,最后用蒸餾水定容至1000mL,最終試劑含0.01%考馬斯亮藍G-250,4.7%乙醇,8.5%磷酸,置于棕色瓶中備用。2.3試驗溶液的制備精確稱取野木瓜多糖100.00mg,加蒸餾水溶解定容至100mL,即為1mg/mL供試品溶液。2.4測試程序和方法:考馬斯亮藍g-200學生,10.10.8、10.8、10.9、10.9、10.9、10.9、10.9、10.9、10.9、10.9、10.9、10.9、10.8、10.9、10.9、10.9、10.8、10.8、10.9、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.9、10.9、10.9、10.9.9、10.9.9、10.9.9、10.9.9.9.9.9.9.9.9.9.9.9.9.9.9.9.9,10.9.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8分別精密吸取標準蛋白質溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.5、0.7、0.8、0.9、1.0mL于10mL具塞試管中,各管加水至1mL,加入考馬斯亮藍G-250溶液5mL,混勻,放置10min,于595nm處測定其吸光度。2.5樣品中的蛋白質含量測定取供試品溶液各1mL,同時做三個重復,以空白試劑為參比,按上述標準曲線的測定法,分別測定其吸光度值,計算樣品中蛋白質的含量。3結果3.1繪制標準曲線用紫外分光光度計,以試劑空白參比,在595nm波長處測定對照品溶液吸光度。以吸光度為縱坐標,蛋白質濃度為橫坐標,繪制標準曲線見圖1。得其線性回歸方程式Y=0.00635X+0.15735,R2=0.99859,相關系數(shù)r=0.9993,表明蛋白質在1.67μg/mL~16.67μg/mL范圍內(nèi)很好地符合郎伯-比爾(LamberBeer)定律。3.2蛋白質含量測定按上述蛋白質含量測定方法,同時做三個重復,經(jīng)測定吸光度值分別為0.290、0.282、0.286,計算得野木瓜多糖中蛋白質含量分別為12.57%、11.77%、12.17%平均含量為12.17%。3.3穩(wěn)定實驗取同一供試品溶液1mL,每隔10min測定1次,觀測其穩(wěn)定性,結果表明在顯色60min時間內(nèi)吸光度穩(wěn)定性較好,結果見表1。3.4精密度試驗精密吸取標準溶液(100μg/mL)0.5mL進行精密度試驗,連續(xù)進行6次測定其吸光度,得RSD=0.58%小于5%,表明精密度好,結果見表2。3.5測定重現(xiàn)性檢驗精密吸取來自同一批原料的試樣,按樣品測定方法,分別測定其吸光度,檢驗該測定方法的重現(xiàn)性,得RSD=2.37%,小于5%,表明重復性較好,結果見表3。3.6加標回收率的測定精密吸取已配制的1mg/mL供試品溶液0.5mL,分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL的蛋白質標準溶液,按樣品測定方法,分別測定其吸光度,計算回收率,結果見表4,樣品平均回收率均為100.99%,RSD為2