g-500染色法測定乳制品中的蛋白質(zhì)

g-500染色法測定乳制品中的蛋白質(zhì)

嬰兒是一種富含豐富、全面的食品。這是人體所需的重要蛋白質(zhì)來源。乳品中蛋白質(zhì)測定的國家標(biāo)準(zhǔn)方法是凱氏定氮法,即將樣品用強酸硝化后測定硝化液中的總氮含量,再由總氮量計算出蛋白質(zhì)的含量。該法測得的結(jié)果其實是蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)含氮物的總量,而且檢測時間長、用酸量大、污染嚴(yán)重、分析結(jié)果離散程度高。本研究采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法對市售乳品中的蛋白質(zhì)含量進行測定,與傳統(tǒng)分析方法相比,該方法操作簡便、經(jīng)濟且結(jié)果較為準(zhǔn)確,尤其適合于測定低濃度的蛋白質(zhì)樣品。1實驗材料、設(shè)備和原則1.1白砂糖、考馬斯亮藍(lán)g-25、進口試劑市售鮮牛奶:伊利、蒙牛、佳寶;牛血清白蛋白:進口分裝,Sigma公司;考馬斯亮藍(lán)G-250:進口分裝,上海進出口試劑公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。1.2設(shè)備UV-210可見-紫外分光光度計(日本UNICO);DL-5型離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。1.3蛋白質(zhì)-考馬斯亮藍(lán)混合物的濃度蛋白質(zhì)分子多肽鏈中具有酰胺基結(jié)構(gòu),這些結(jié)構(gòu)可以與棕紅色的考馬斯亮藍(lán)G-250染料的陰離子相互作用形成染色復(fù)合物,使溶液的顏色由棕紅色變?yōu)樗{(lán)色,其最大吸收波長也由465nm變化為595nm,當(dāng)待測溶液中蛋白質(zhì)含量在1~1000μg/mL范圍內(nèi),蛋白質(zhì)-考馬斯亮藍(lán)復(fù)合物在595nm波長下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比,據(jù)此可用于蛋白質(zhì)含量分析。2方法2.1對照品溶液的制備精密稱取牛血清白蛋白10.00mg,用少量蒸餾水溶解,再用蒸餾水稀釋至100mL,即為0.1mg/mL蛋白質(zhì)對照品溶液,置4℃冰箱中存放。2.2馬斯亮藍(lán)g-200試劑的制備精密稱取考馬斯亮藍(lán)G-250100.00mg加入95%乙醇50mL、85%磷酸100mL,溶解充分后用蒸餾水稀釋至1000mL,最終試劑中考馬斯亮藍(lán)G-250含量為0.01%,乙醇含量為4.7%,磷酸含量為8.5%,置棕色瓶中密塞備用。2.3供試品溶液的制備取供試鮮牛奶在3000r/min離心10min,棄去上層乳脂,精密吸取脫脂鮮奶0.5mL加蒸餾水稀釋至100mL,即得供試品溶液。2.4測波長的確定分別精密吸取蛋白質(zhì)對照品溶液0.0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8mL于10mL具塞試管中,各管加水至1mL,加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液4mL,混勻,放置10min于595nm波長處測定吸光度。2.5樣品中的蛋白質(zhì)含量測定取供試品溶液0.5mL,同時作3個重復(fù),以隨行試劑為空白,按照2.4方法分別測定吸光度,計算供試樣品中蛋白質(zhì)含量。3結(jié)果3.1蛋白質(zhì)濃度的測定用可見-紫外分光光度計以隨行試劑為空白,在595nm波長處測定對照品梯度溶液吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo)y,蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)x,進行線性回歸得回歸方程:y=85.153x-1.6001,r=0.9991。表明蛋白質(zhì)在10~80μg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度之間符合Lamber-Beer定律。3.2新鮮奶的蛋白質(zhì)含量是市場上按照前述分析方法每種乳品做3個重復(fù),經(jīng)計算得供試品中蛋白質(zhì)含量,見表1。3.3顯色穩(wěn)定性測定取同一供試品溶液0.5mL按照上述方法操作,每隔10min測定一次,觀察其顯色穩(wěn)定性,結(jié)果顯示,實驗溶液顯色60min內(nèi)吸光度穩(wěn)定性良好見表2。3.4標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的精髓測試精密吸取對照品溶液0.5mL,連續(xù)進行6次分析,結(jié)果見表3,由表3數(shù)據(jù)可知本法分析精密度良好。3.5樣品的重建試驗精密吸取同一供試品溶液0.5mL,連續(xù)進行6次分析,結(jié)果見表4,由表4數(shù)據(jù)可知本方法分析結(jié)果重現(xiàn)性良好。3.6加標(biāo)回收率測定精密吸取已測得含量的脫脂鮮牛奶供試溶液0.5mL,分別加入蛋白質(zhì)對照品溶液0.1,0.2,0.3,0.4,0.5mL,加蒸餾水補足至1mL,按照樣品測定法測吸光度,計算回收率,見表5。4考馬斯亮藍(lán)法顯色法牛乳中乳蛋白的主要成分是酪蛋白和乳清蛋白,乳蛋白的含量隨著乳牛品種及營養(yǎng)狀況的不同而有差異,在人工飼養(yǎng)條件下可通過乳蛋白含量水平初步判斷牛乳的質(zhì)量與營養(yǎng)價值高低?？捡R斯亮藍(lán)法顯色是由其陰離子與蛋白質(zhì)中的NH+4基通過靜電引力而發(fā)生化學(xué)反應(yīng),不同蛋白質(zhì)中NH+4基含量不同,不同取代位置的NH+4基與染料的相互作用也有差異,因此為使牛乳中蛋白質(zhì)測定更加準(zhǔn)確,最好使用牛血清白蛋白作為測定用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),亦可采用胰凝乳蛋白酶