五指毛桃水提取物和醇提物的量效關系比較

五指毛桃水提取物和醇提物的量效關系比較

第五指毛桃是黑莓科植物的粗葉榕樹。它嘗起來又冷又甜，性質(zhì)溫和。具有益氣健脾、益肺、補水健筋的功效。屬于補藥類，在人們中被廣泛使用。我相信它會對類似于黃黃子的補氣和恢復起到同樣的作用。本文從抗應激、免疫調(diào)節(jié)及補血三個方面來研究比較五指毛桃不同提取物的補益作用,現(xiàn)報道如下。1材料和機器1.1實驗動物SPF級KM小鼠,體質(zhì)量18~22g,由廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供,合格證號:SCXK粵2003-0001。1.2毛桃醇提物的制備五指毛桃、黃芪購于采芝林藥店,經(jīng)鑒定均為正品。五指毛桃、黃芪水提液的制備方法:取五指毛桃、黃芪的干燥藥材,用10倍量(M/M)蒸餾水浸泡1h后,加熱煮沸1h,趁熱濾取藥液;再加8倍量水,煮沸30min,合并兩次濾液,濃縮至2g/mL備用,用時加蒸餾水稀釋至所需濃度。五指毛桃醇提物的制備方法:取五指毛桃干燥藥材,用10倍量95%乙醇浸泡1h后,冷凝回流2h,趁熱濾取藥液;再加8倍量95%乙醇回流提取1h,合并兩次濾液,用薄膜蒸發(fā)儀減壓回流濃縮至生藥含量2g/mL,用時加蒸餾水稀釋至所需濃度。無水葡萄糖由天津市大茂化學試劑廠生產(chǎn),批號060211。鈉石灰、檸檬酸、檸檬酸三鈉、碳酸鈉均由廣州化學試劑有限公司生產(chǎn),批號分別為060101-1、20060503-2、20070104-2、20030326。二硝基氯苯由上海試劑一廠生產(chǎn),批號20000101。醋酸潑尼松由廣東華南藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號071104。1.3儀器、儀器和培養(yǎng)箱MEK-6318K血球記數(shù)儀由日本光電公司生產(chǎn);PeriFlux5000激光多普勒血流監(jiān)測儀由瑞典Perimed公司生產(chǎn);UNICO7200型可見分光光度計由尤尼柯上海儀器有限公司生產(chǎn);AnkeTGL-16G型高速離心機由上海安亭科學儀器廠生產(chǎn);WGP-450型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱由上海躍進醫(yī)療器械廠生產(chǎn);CU-600型電熱恒溫水箱由上海一恒科技有限公司生產(chǎn)。2對小鼠免疫功能的影響2.1五指毛桃不同提取物對小鼠抗應激的影響2.1.1抗疲勞實驗:KM小鼠,雌雄各半,隨機分成6組:空白組,黃芪水提物組(10g/kg),五指毛桃水提物高(20g/kg)、低劑量組(5g/kg),五指毛桃醇提物高(20g/kg)、低劑量組(5g/kg),灌胃給藥,1次/天,連續(xù)6d?？瞻捉M給予等容積蒸餾水。末次給藥后1h,在小鼠尾根部束一個相當于小鼠體質(zhì)量10%的鐵環(huán),將小鼠放入水深20cm、水溫20℃±1℃的水池中,記錄小鼠從開始游泳至體力耗竭的時間,以小鼠頭部沉入水中10s不能浮出水面為體力耗竭。2.1.2耐常壓缺氧實驗:分組及給藥同“2.1.1”項。末次給藥后1h,將小鼠放入盛有5g鈉石灰的等容積帶膠塞的玻璃瓶內(nèi),每次每組1只,將瓶口密封計時,以停止呼吸為指標觀察小鼠存活的時間。2.1.3耐腦缺血缺氧實驗:分組及給藥同“2.1.1”項。末次給藥后1h,用剪刀齊耳斷頭,立即計時觀察斷頭后小鼠口開合的持續(xù)時間。2.2五指毛桃不同提取物對小鼠免疫功能的影響2.2.1對巨噬細胞吞噬能力的影響:KM小鼠,雌雄各半,隨機分成7組:空白組,模型組,黃芪水提物組(10g/kg),五指毛桃水提物高(20g/kg)、低劑量組(5g/kg),五指毛桃醇提物高(20g/kg)、低劑量組(5g/kg)。除空白組外,其他各組小鼠上午灌胃給予30mg/kg醋酸潑尼松,下午空白組和模型組灌服等容積的蒸餾水,其他組小鼠灌胃給予相應藥物,連續(xù)12d。末次給藥后30min,尾靜脈注射25%中華墨汁生理鹽水溶液10mL/kg,分別于注射后2min和12min,用毛細玻管(預先用肝素鈉溶液潤濕)眼球取血1~2滴,用微量進樣器吸20μL溶于5mL0.1%Na2CO3溶液中,搖勻后于紫外分光光度計680nm下比色,測光密度D(λ)值計算廓清指數(shù)K。廓清指數(shù)Κ=logD(λ)2-logD(λ)12Τ12-Τ2D(λ)2、D(λ)12分別為2、12min時的光密度;T12、T2分別為時間12、2min。2.2.2對血清溶血素抗體水平的影響:分組同“2.2.1”項。除空白組外,其余各組小鼠先腹腔注射5%生理鹽水雞紅細胞懸液0.2mL/只進行免疫,然后灌胃給藥,連續(xù)12d,空白組和模型組給等容積蒸餾水。末次給藥后1h,各組小鼠摘眼球取血,3000r/min離心10min,取30μL血清用生理鹽水稀釋100倍,取稀釋后的血清1mL,與5%生理鹽水雞血細胞混懸液0.5mL,10%補體0.5mL混合,在37℃恒溫箱中保溫30min后,0℃冰箱中止反應,然后離心,取上清液于分光光度計540nm處比色,測D(λ)值,另設不加血清的空白對照,取其上清液作為比色時調(diào)零的基準。2.2.3對皮膚遲發(fā)性過敏反應的影響:分組同“2.2.1”項。除空白組外,其余各組均用20%二硝基氯苯丙酮溶液20μL/只涂于小鼠右耳致敏,致敏后的第5d各組小鼠開始灌胃給予相應藥物,每天1次,連續(xù)12d。致敏后第12d將2.5%二硝基氯苯丙酮溶液20μL/只涂于小鼠右耳進行攻擊,24h脫頸椎處死小鼠,剪下兩耳,用打孔器在兩耳相同位置打下耳部皮膚,分別稱量質(zhì)量,求兩耳的質(zhì)量差。2.3五指毛桃不同提取物對貧血小鼠的影響2.3.1對失血性貧血小鼠的影響:分組同“2.2.1”項。除空白組外,其他各組小鼠于第1、4、7天眼眶放血7~8滴(約0.3mL)。造模第1天開始灌胃給藥,連續(xù)16d,空白組、模型組給予等容積蒸餾水。末次給藥后1h,小鼠眼球取血用EDTA抗凝測Hb及RBC。2.3.2對環(huán)磷酰胺所致小鼠貧血的影響:分組給藥同“2.2.1”項。除空白組外,其他各組小鼠于實驗的第1天腹腔注射環(huán)磷酰胺100mg/kg致骨髓造血功能抑制建立貧血模型,連續(xù)給藥16d,空白組、模型組給予等容積的蒸餾水。末次給藥后1h,眼球取血用EDTA抗凝測Hb及RBC。2.4統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)用ˉx±s表示,結果用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行t檢驗分析。3結果3.15-指毛桃提取的不同對大鼠的抗抑郁作用3.1.1毛桃醇提物對小鼠稱重游泳時間的影響結果如表1所示,與空白組比較,黃芪水提物組小鼠負重游泳時間明顯延長(P<0.01);五指毛桃醇提物高、低劑量組效果明顯(P<0.05或P<0.01);水提物高、低劑量可延長小鼠負重游泳時間,但與空白組比較無顯著性差異(P>0.05)。提示五指毛桃醇提物增強小鼠負重游泳耐力的作用比水提物更明顯。3.1.2不同水提物對小鼠耐u3000活性染料耐從量組織中,對小鼠耐ue結果如表2所示,與空白組比較,五指毛桃醇提物高劑量能明顯延長小鼠耐常壓缺氧存活時間(P<0.05),效果與10g/kg的黃芪水提物相當;醇提物低劑量組及水提物高、低劑量組與空白組比較均無顯著性差異(P>0.05),但醇提物低劑量組對小鼠耐常壓缺氧存活時間的影響大于水提物高、低劑量組。提示五指毛桃醇提物抗缺氧作用比水提物更明顯。3.1.3毛桃水提物對小鼠斷頭后呼吸道行為的影響結果如表3所示,與空白組相比,五指毛桃醇提物高、低劑量均能顯著延長小鼠斷頭后喘息時間(P<0.01),效果與10g/kg劑量的黃芪水提物相當;五指毛桃水提物高、低劑量對小鼠斷頭后喘息時間的影響不大(P>0.05),但也有一定的效果。提示五指毛桃醇提物抗缺血缺氧的作比水提物用更明顯。3.25-指毛桃提取的不同對大鼠免疫功能的影響3.2.1毛桃醇提物對炭粒廓清指數(shù)的影響結果如表4所示,與空白組比較,模型組小鼠碳粒廓清指數(shù)顯著降低(P<0.01),表明模型建立成功。與模型組比較,五指毛桃醇提物高劑量組炭粒廓清指數(shù)明顯增大(P<0.05),但效果不及黃芪水提物;醇提物低劑量與水提物高、低組具有增大廓清指數(shù)的趨勢,其中醇提物低劑量組對小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響大于水提物高、低劑量組,3個組與模型組比較均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。提示五指毛桃醇提物調(diào)節(jié)免疫功能的作用大于水提液。3.2.2各組小鼠血清抗體檢測結果結果如表5所示,經(jīng)雞紅細胞免疫后,模型組小鼠血清中的抗體水平明顯提高,D(λ)值顯著大于空白組(P<0.01),表明模型建立成功。與模型組相比,其余給藥組均有增加血清抗體的作用,其中黃芪水提物及五指毛桃醇提物高、低劑量效果極為顯著(P<0.01),其次為五指毛桃水提物高劑量組(P<0.05),水提物低劑量組影響較小(P>0.05)。提示五指毛桃醇提物提高血清溶血素抗體水平的作用大于水提物。3.2.3毛桃醇提物對耳水腫度的影響結果如表6所示,與空白組比較,用DNCB致敏后,模型組小鼠耳腫脹程度明顯增強(P<0.01),表明模型建立成功。與模型組比較,五指毛桃醇提物高、低劑量組均可明顯增加耳腫脹度(P<0.05或P<0.01);水提物高、低劑量組有增加耳腫脹度的趨勢,但影響不大(P>0.05)。提示五指毛桃醇提物增強皮膚遲發(fā)性過敏反應的作用大于水提物。3.35-指不同提取的毛桃對貧困學生大鼠的影響3.3.1模型成功后小鼠rbc和失血性開發(fā)出的小鼠結果如表7所示,與空白組比較,模型組RBC顯著降低(P<0.01),Hb明顯減少(P<0.05),表明失血致小鼠貧血模型成功。五指毛桃水提物和醇提物組均有提高失血性貧血小鼠RBC的趨勢,但與模型組比較均無差異性(P>0.05);與模型組比較,五指毛桃醇提物高、低劑量及水提物高劑量均能明顯提高Hb(P<0.05),水提物低劑量組影響不大(P>0.05);水提物對RBC及Hb的影響總體不及醇提物。提示五指毛桃醇提物對失血所致貧血小鼠的補血作用優(yōu)于水提物。3.3.2對小鼠血紅蛋白nd活性的影響結果如表8所示,與空白組比較,模型組小鼠RBC和Hb水平明顯降低(P<0.01),說明環(huán)磷酰胺致小鼠貧血模型成功。與模型組比較,黃芪水提液組、五指毛桃醇提物高、低劑量組均明顯增加RBC和提高Hb(P<0.05或P<0.01);水提物高、低劑量組有增加RBC和提高Hb的趨勢,但影響不大(P>0.05)。提示五指毛桃醇提物對環(huán)磷酰胺所致貧血小鼠的補血作用優(yōu)于水提物。4醇提物和黃芪的臨床使用效果五指毛桃是一種食藥同源的植物,在兩廣地區(qū)民間用于煲湯,稱為“南芪”。前期研究表明,五指毛桃水提物具有調(diào)節(jié)免疫功能、抗應激及補血的作用。近年來有文獻報道證明補骨脂素為五指毛桃的主要活性成分之一,分離鑒定出的補骨脂素為呋喃香豆素類化合物,具有抗菌、抗病毒、抗凝血、抑制腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用,并對紅細胞系統(tǒng)的造血有一定的促進作用,而乙醇提取法能有效提取補骨脂素和佛手內(nèi)酯等成分。應激是機體處于各種不利的內(nèi)、外環(huán)境條件下所進行的一系列反應。疲勞、缺氧、缺血是常見的3種應激原,通常作為反映藥物抗應激能力的重要指標。巨噬細胞吞噬能力、血清溶血素抗體水平、皮膚遲發(fā)性過敏反應通常用來反映藥物對機體非特異性免疫、體液免疫和細胞免疫的影響。失血性貧血和骨髓抑制性貧血模型則通常用來反映藥物改善貧血的作用。實驗結果表明,五指毛桃醇提物能提高免疫低下小鼠炭粒廓清指數(shù),提高小鼠血清溶血素水平及增強小鼠皮膚遲發(fā)性過敏反應;能夠延長小鼠耐缺氧存活時間、負重游泳時間及斷頭后喘息時間;能夠提高失血性貧血及骨髓抑制性貧血小鼠的紅細胞數(shù)量RBC和血紅蛋白Hb含量。五指毛桃水提物和醇提物相比較,醇提物在抗應激、調(diào)節(jié)機體免疫功能及改善貧血方面均