粉塵螨浸出液對(duì)小兒支氣管哮喘體外刺激的研究

粉塵螨浸出液對(duì)小兒支氣管哮喘體外刺激的研究

氣管哮喘是由各種細(xì)胞和細(xì)胞組成的慢性呼吸道炎癥疾病，其中t淋巴細(xì)胞對(duì)呼吸道炎癥有主要的抑制作用。接觸過(guò)敏原后淋巴細(xì)胞的增殖、分化及反應(yīng)決定著過(guò)敏性哮喘的發(fā)展、變化和轉(zhuǎn)歸。常見(jiàn)的研究淋巴細(xì)胞功能的方法為給予淋巴細(xì)胞特異性或非特異性的刺激,如植物血凝素(PHA)等,檢測(cè)刺激后淋巴細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子分泌情況,從而了解淋巴細(xì)胞的功能。而對(duì)于有明確過(guò)敏原的支氣管哮喘患兒給予特異性過(guò)敏原浸出液刺激則可能更接近于疾病的真實(shí)狀況。因此我們擬觀察對(duì)粉塵螨過(guò)敏的支氣管哮喘患兒的外周血淋巴細(xì)胞在體外接受粉塵螨特異性變應(yīng)原刺激后的增殖情況,確定粉塵螨特異性變應(yīng)原刺激所需的最佳刺激濃度和刺激時(shí)間,從而為體外研究對(duì)粉塵螨過(guò)敏的支氣管哮喘患兒淋巴細(xì)胞功能提供可靠的實(shí)驗(yàn)室方法。1數(shù)據(jù)和方法1.1對(duì)粉塵病2010年1月至2011年1月我院收治的支氣管哮喘患兒40例,根據(jù)2008年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)會(huì)呼吸學(xué)組制定的《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》中兒童支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn),選擇對(duì)粉塵螨過(guò)敏[粉塵螨過(guò)敏原皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)陽(yáng)性,風(fēng)團(tuán)反應(yīng)范圍≥(++);粉塵螨特異性IgE≥0.7kU/L]的中度支氣管哮喘患兒20例作為粉塵螨過(guò)敏組,男11例,女9例,年齡3～13歲,平均(5.7±2.1)歲,病程(3.23±1.16)年,同時(shí)選擇非粉塵螨過(guò)敏的中度支氣管哮喘患兒20例作為非粉塵螨過(guò)敏組;男13例,女7例,年齡3～13歲,平均(5.6±2.3)歲,病程(3.59±1.89)年,兩組患兒在性別、年齡、病程以及病情嚴(yán)重程度方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,具有可比性。1.2糖激素布地奈德兩組在采血前4周內(nèi)未全身使用糖皮質(zhì)激素及其他免疫抑制劑;兩組的基礎(chǔ)用藥相同,均應(yīng)用小至中等劑量的吸入型糖皮質(zhì)激素(布地奈德吸入劑),必要時(shí)應(yīng)用β2受體激動(dòng)劑(硫酸沙丁胺醇吸入劑),不合并使用長(zhǎng)效抗組胺及抗白三烯類藥物。1.3變應(yīng)原風(fēng)團(tuán)反應(yīng)范圍過(guò)敏原皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)操作按國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。以變應(yīng)原與組胺(陽(yáng)性對(duì)照液)所致風(fēng)團(tuán)面積比確定其反應(yīng)級(jí)別:①變應(yīng)原風(fēng)團(tuán)反應(yīng)與陰性對(duì)照相同為(-);②風(fēng)團(tuán)反應(yīng)范圍為陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)的25%～50%為(+);③風(fēng)團(tuán)反應(yīng)范圍為陽(yáng)性對(duì)照的>50%～100%為(++);④風(fēng)團(tuán)反應(yīng)范圍為陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)的>100%～200%為(+++);⑤風(fēng)團(tuán)反應(yīng)范圍為陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)的>200%以上為(++++)。(++)及以上者定為陽(yáng)性。1.4不同途徑輸注rpmi1840培養(yǎng)基后細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)采取外周靜脈血4ml,肝素鈉抗凝,應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞并進(jìn)行淋巴細(xì)胞活力檢測(cè)(活力>90%)。用含10%小牛血清的完全RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整淋巴細(xì)胞濃度為1×106/ml,接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi),將每例患兒的淋巴細(xì)胞平均分為8孔,每孔500μl,8孔粉塵螨浸出液抗原濃度分別為:0、5、10、20、40、60、80、100mg/L。于37℃5%二氧化碳(CO2)飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48及72小時(shí)后應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(CCK-8)檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖情況。1.5細(xì)胞控制液①分別于培養(yǎng)后24、48及72小時(shí)吸取各孔淋巴細(xì)胞50μl轉(zhuǎn)入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,各做3個(gè)復(fù)孔,并設(shè)空白對(duì)照孔,即孔內(nèi)不含淋巴細(xì)胞,而僅含RPMI-1640培養(yǎng)基;②每孔加入CCK-8試劑5μl,于5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育2小時(shí);③應(yīng)用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在450nm測(cè)定吸光度,同時(shí)將650nm作為參考波長(zhǎng)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定。讀取吸光度(A)值。按下式計(jì)算不同濃度戶塵螨浸出液刺激淋巴細(xì)胞增殖的刺激指數(shù)(SI)。SI=(刺激孔A值-空白孔A值)/(未刺激孔A值-空白孔A值)。1.6均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差擬合應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù),所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,兩組不同時(shí)點(diǎn)的比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2商業(yè)血藥濃度對(duì)細(xì)胞增生si的影響在接受戶塵螨浸出液20mg/L、40mg/L刺激時(shí),粉塵螨過(guò)敏組在培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)的過(guò)程中,淋巴細(xì)胞增殖的SI均呈先升高后降低的趨勢(shì),而在刺激物濃度為80mg/L時(shí),粉塵螨過(guò)敏組淋巴細(xì)胞增殖的SI則是逐漸降低的;在非粉塵螨過(guò)敏組,這種升高和降低的趨勢(shì)不明顯,兩組在組間、不同時(shí)點(diǎn)以及組間和不同時(shí)點(diǎn)的交互作用中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01),粉塵螨浸出液刺激濃度為40mg/L,培養(yǎng)48小時(shí)時(shí)的淋巴細(xì)胞增殖的SI最高,見(jiàn)表1。3cck-8實(shí)驗(yàn)方法主要引起受精神病理的細(xì)胞增殖,其符合現(xiàn)代各學(xué)發(fā)展的三大主要趨勢(shì)淋巴細(xì)胞在體外經(jīng)某種物質(zhì)刺激后其代謝及形態(tài)將相繼發(fā)生變化,此為淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn),亦稱淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)。此過(guò)程首先表現(xiàn)為短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞的表面電荷發(fā)生變化,數(shù)小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)酶活化,24～48小時(shí)內(nèi)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸合成增加,進(jìn)而產(chǎn)生一系列的增殖變化,表現(xiàn)為細(xì)胞變大、細(xì)胞漿擴(kuò)大、出現(xiàn)空泡、核仁明顯、染色質(zhì)疏松,最終淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)變成淋巴母細(xì)胞。在體外,我們可以利用各種刺激物激發(fā)淋巴細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化,并根據(jù)其轉(zhuǎn)化程度測(cè)定淋巴細(xì)胞的應(yīng)答功能。此方法現(xiàn)已作為測(cè)定人體細(xì)胞免疫功能的指標(biāo)之一。刺激淋巴細(xì)胞增殖的物質(zhì)可分為2類:非特異性刺激物和特異性刺激物。其中,非特異性刺激物主要包括植物性分裂因子如PHA、刀豆蛋白A(ConA)等,此外,淋巴細(xì)胞也可以通過(guò)細(xì)菌性毒素引起分裂增殖,甚至單是混合不同類型的細(xì)胞就可迅速引起大量的有絲分裂。上述各種刺激物中以PHA應(yīng)用最廣,在體外淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中,PHA可使正常人外周血液中T淋巴細(xì)胞60%～80%發(fā)生轉(zhuǎn)化,其所引起的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率大大超過(guò)特異性抗原的作用。但這種反應(yīng)與機(jī)體是否致敏無(wú)關(guān),因此是屬于非特異性的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。特異性刺激物主要是指特異性抗原物質(zhì)。不同的特異性抗原物質(zhì)可刺激不同的淋巴細(xì)胞分化、增殖,因而可以其反映不同淋巴細(xì)胞群體的免疫功能。因特異性抗原僅能使相應(yīng)抗原致敏的淋巴細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化率一般在5%～30%左右。檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖的方法很多,有氚標(biāo)記胸腺嘧啶核苷摻入法、乳酸脫氫酶釋放法、形態(tài)學(xué)法、比色法、流式細(xì)胞儀法等。同位素標(biāo)記方法靈敏,但由于其存在的放射性污染而使其應(yīng)用受到限制。而四唑鹽(MTT)比色法其靈敏度和準(zhǔn)確度不高。在MTT法中,由于反應(yīng)所生成的甲臢晶體沉淀,需要使用適當(dāng)?shù)牧呀庖喝芙夂蟛拍軠y(cè)出細(xì)胞的吸光度值,不同裂解液的溶解能力及其產(chǎn)生的背景信號(hào)對(duì)吸光度值的測(cè)量結(jié)果有較大的影響,這是一種系統(tǒng)誤差,而實(shí)際操作中也容易由于在吸取上清時(shí)會(huì)帶走部分細(xì)胞,而導(dǎo)致偶然誤差。而CCK-8試劑盒是一種基于2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽(WST-8)的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒。WST-8是一種類似于MTT的化合物,在電子耦合試劑存在的情況下,可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成橙黃色的甲臢晶體。細(xì)胞增殖越多越快,則顏色越深;對(duì)于同樣的細(xì)胞,顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系。WST-8是MTT的一種升級(jí)替代產(chǎn)品,和MTT或其他MTT類似產(chǎn)品如二甲氧唑黃比色法(XTT)等相比有明顯的優(yōu)點(diǎn)。WST-8產(chǎn)生的甲臢晶體是水溶性的,不需特定的溶解液來(lái)溶解,同時(shí)也不需要吸取上清,不容易造成細(xì)胞的丟失,因而數(shù)據(jù)穩(wěn)定。另外,WST-8和MTT、XTT相比,線性范圍更寬,靈敏度更高。目前CCK-8法已被公認(rèn)為是一種操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、步驟少、結(jié)果準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好的細(xì)胞活性檢測(cè)方法。本試驗(yàn)選用CCK-8法檢測(cè)淋巴細(xì)