五種中藥對環(huán)磷酰胺造模小鼠的保護(hù)作用

五種中藥對環(huán)磷酰胺造模小鼠的保護(hù)作用

氨基丙烯酸酯（cyclopediacp）是目前臨床上常用的烷基性腫瘤藥物。同時，它也是一種免疫抑制劑。它不僅破壞腫瘤細(xì)胞，而且破壞正常的組織細(xì)胞，尤其是血液和淋巴體組織的細(xì)胞。有很多副作用。補(bǔ)益類中藥在腫瘤治療中有一定的應(yīng)用,可治療癌前期病變,預(yù)防腫瘤發(fā)生、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移;減輕放化療毒副反應(yīng);治療中晚期腫瘤,改善癥狀;提高生存質(zhì)量、延長帶瘤生存時間。本研究從以往課題中選取了5種具有抗突變作用的補(bǔ)益方,從不同方面(免疫系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng))和不同水平(細(xì)胞、分子水平)探討了補(bǔ)益方對環(huán)磷酰胺毒性的拮抗作用。為臨床選用補(bǔ)益方輔助化療提供實驗依據(jù)。1實驗材料1.1中藥、成湯、顆粒、生脈散六味地黃湯按《小兒藥證直訣》:熟地黃24g、山茱萸12g、山藥12g、澤瀉9g、牡丹皮9g、茯苓9g;金匱腎氣湯按《金匱要略》:生地黃24g、薯蕷12g、山茱萸12g、澤瀉9g、茯苓9g、牡丹皮9g、桂枝3g、附子3g;理中湯按《傷寒論》:黨參15g、白術(shù)15g、干姜15g、炙甘草15g;四君子湯按《太平惠民和劑局方》人參12g、白術(shù)9g、茯苓9g、炙甘草4.5g;生脈散出自《內(nèi)外傷辨感論》:人參10g、麥冬15g、五味子6g。以上中藥均由南京中醫(yī)藥大學(xué)門診部提供。每種方藥均加適量水浸泡2h,加熱煮沸30min,濾出頭煎,藥渣加水適量,再煮沸30min,濾出2煎,將2次濾液合并,加熱濃縮至100mL。六味地黃湯、金匱腎氣湯、理中湯、四君子湯、生脈散藥液濃度分別為:0.75,0.81,0.60,0.345,0.31g·mL-1。1.2rt-pcr法環(huán)磷酰胺(CP),購自上海華聯(lián)制藥公司;碘化丙啶,Sigma公司;Giemsa染液,南京生興公司;TRIZOl,invitrogen;Rt-PCR試劑盒,Promega;溴乙錠:南京生達(dá)生物研究所;瓊脂糖,中國醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司;EDTA,南京生興公司;溴酚蘭、Tris、硼酸(分析純),中國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司;抗氧化試劑盒,南京聚力生物醫(yī)學(xué)工程研究所。1.3實驗動物ICR純種小鼠(20～22)g,雌雄均可,由南京中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。2實驗方法2.1模型組和正常組及時igICR小鼠隨機(jī)分組,每組8只,分為正常對照組、環(huán)磷酰胺模型組及用藥組。模型組和正常對照組連續(xù)用蒸餾水ig10d,用藥組每天分別ig(相當(dāng)于臨床等效量),連續(xù)10d。小鼠處死前30h,除正常對照組外各組小鼠分別ip環(huán)磷酰胺(CP)0.040g·kg-1。2.2小鼠骨髓細(xì)胞的提取摘眼球取血,制備血清;于ig第10天,頸椎脫臼處死小鼠,取小鼠雙側(cè)股骨,剪去骨垢,通過注射器用生理鹽水沖出骨髓細(xì)胞,用離心管收集備用;取小鼠胸腺、脾臟,稱重后用載玻片碾磨,用生理鹽水制成細(xì)胞懸液備用。2.3兩組后氣染色將骨髓細(xì)胞懸液離心(1000r·min-1)后去上清液,用37℃預(yù)溫的0.4%KCl低滲8min,用固定液(甲醇∶冰醋酸為3∶1)固定兩次后氣干法滴片,Giemsa染色。每組標(biāo)本統(tǒng)計5000個細(xì)胞,計算出微核率。2.4細(xì)胞凋亡率測定取骨髓、胸腺、脾細(xì)胞懸液,200目篩網(wǎng)過濾,用PBS洗滌2次后70%冷乙醇固定,-20℃保存。上機(jī)前PBS洗滌,制成細(xì)胞懸液,加入含RNA酶的碘化丙啶(PI)染液,4℃30min,經(jīng)300目尼龍網(wǎng)濾過后,上流式細(xì)胞儀測定各組細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期。每個樣本獲取10000個細(xì)胞,以分析軟件CELLQuset及ModFit2.0分析結(jié)果。2.5引物的擴(kuò)增收獲骨髓細(xì)胞,用TRIZOL試劑提取骨髓細(xì)胞總RNA,RNA變性電泳檢測RNA,一步法Rt-PCR試劑盒擴(kuò)增特異性片段:依據(jù)小鼠P53基因全序列設(shè)計上下游引物,擴(kuò)增引物長度250bp的一個長片段,上游引物ACA～CCT～GAT～CGT～TAC～TCG～GC,下游引物GAG～GGC～TTA～CCA～TCA～CCA～TC,反應(yīng)條件為:48℃,45min→94℃,2min→94℃,35S,56℃,40S,72℃,1min20S,30循環(huán)→72℃,5min→10℃。擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上5V/cm電泳,EB染色,用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行光密度掃描分析。2.6通過脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的測定脾臟、胸腺稱重,計算脾指數(shù)、胸腺指數(shù)。2.7抗氧化酶3種、3種取小鼠血清,用試劑盒進(jìn)行GSH(還原性谷胱甘肽)、CAT(過氧化氫酶)、SOD(超氧化物歧化酶)和MDA(丙二醛)的檢測,測定方法詳見南京聚力生物醫(yī)學(xué)工程研究所提供的試劑盒說明書。3結(jié)果3.1各組小鼠細(xì)胞微核試驗結(jié)果見表1。結(jié)果顯示每組觀察5000個細(xì)胞,模型組與正常組相比:微核率明顯升高,5個用藥組與模型組相比微核率顯著下降。反映了藥物的拮抗作用。3.2血清3ge-3g、b、3g-m期細(xì)胞變化見表2。結(jié)果顯示:模型組與正常對照組相比,G0-G1期細(xì)胞明顯增多,S期細(xì)胞明顯減少,G2-M期細(xì)胞變化不明顯;用藥組與模型組相比,G0-G1期細(xì)胞明顯減少,S期細(xì)胞明顯增多,G2-M期細(xì)胞變化不明顯;藥物組與正常對照組相比,各期細(xì)胞均無明顯差異,可見環(huán)磷酰胺影響骨髓細(xì)胞增殖周期,幾種方藥具有保護(hù)作用。3.3環(huán)磷酰胺對p33基因表達(dá)的影響圖2小鼠骨髓細(xì)胞Rt—PCR結(jié)果初步可見長為250bp的特異電泳帶,且環(huán)磷酰胺組p53基因mRNA表達(dá)與對照組比明顯增強(qiáng),六味地黃湯和四君子湯對環(huán)磷酰胺的這種作用有一定的拮抗效應(yīng)。3.4脾指數(shù)的變化見表3。由表3可見,模型組脾指數(shù)與正常對照組比明顯降低,而金匱腎氣湯、四君子湯、六味地黃湯、生脈散組脾指數(shù)均明顯升高,反映出這些藥物的保護(hù)作用。金匱腎氣湯與正常對照組差異顯著。環(huán)磷酰胺能明顯誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞凋亡,經(jīng)用藥后,六味地黃湯、四君子湯組能明顯拮抗環(huán)磷酰胺引起的脾細(xì)胞凋亡。3.5不同中藥對環(huán)磷酰胺的細(xì)胞增殖抑制率見表4。從表4可以看出,環(huán)磷酰胺能明顯抑制脾細(xì)胞增殖,經(jīng)用藥后,六味地黃湯、四君子湯、生脈散、金匱腎氣湯能拮抗環(huán)磷酰胺引起的脾細(xì)胞增殖抑制,表現(xiàn)為G0+G1期較環(huán)磷酰胺模型組明顯減少,S期明顯增加。3.6真實藥藥對湯、六味地黃湯胸腺指數(shù)的影響見表5。由表5可見,環(huán)磷酰胺模型組胸腺指數(shù)與正常對照組比明顯降低,而理中湯、金匱腎氣湯、四君子湯、六味地黃湯胸腺指數(shù)均有升高,反映出這些藥物的保護(hù)作用。生脈散組結(jié)果不明顯。模型組與正常對照組相比,胸腺G0-G1期細(xì)胞明顯增多,S期細(xì)胞明顯減少,G2-M期細(xì)胞變化不明顯;藥物組與模型組相比,5種藥物組均使G0-G1期細(xì)胞明顯減少,S期細(xì)胞明顯增多,G2-M期細(xì)胞變化不明顯。3.7小鼠血清sod和gsh的變化GSH、CAT、SOD、MDA見表6。表6結(jié)果表明:與正常對照組相比,模型組GSH的含量、CAT活力、SOD值明顯低于正常對照組,MDA值高于正常對照組,5種方藥均能拮抗環(huán)磷酰胺對小鼠血清CAT的活力的抑制作用;使環(huán)磷酰胺降低的小鼠血清GSH有不同程度的提高(理中湯不明顯);對環(huán)磷酰胺組造成的MDA增高具有抑制作用(金匱腎氣湯不明顯),此外六味地黃湯與四君子湯用藥組的SOD活力明顯高于環(huán)磷酰胺模型組。4益方和藥的相互作用在腫瘤治療中如何降低放療、化療的毒副作用、改善腫瘤病人的狀況已經(jīng)成為治療腫瘤的關(guān)鍵。傳統(tǒng)中醫(yī)藥在癌癥的治療中有其獨(dú)到之處,用中醫(yī)藥進(jìn)行治療常可改善癥狀、緩解病情,從而提高病人的生存質(zhì)量、延長生命。祖國醫(yī)學(xué)中很多補(bǔ)益類的名方、經(jīng)方都有扶正固本、提高機(jī)體免疫功能等作用,若能將傳統(tǒng)中醫(yī)藥與化療結(jié)合起來,達(dá)到既能殺傷腫瘤細(xì)胞,又能維持機(jī)體較好的免疫狀態(tài),提高機(jī)體清除突變細(xì)胞的能力,將不失為一條治療腫瘤的好途徑。圍繞補(bǔ)益方、藥抑制化療藥物環(huán)磷酰胺的遺傳毒性,我們已完成了多項課題。六味地黃湯、理中湯、四君子湯、生脈散、金匱腎氣湯是以往課題中篩選出來的方藥,均為補(bǔ)益代表方,臨床上具有治療虛證、扶正固本的作用,本研究從不同方面(免疫系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng))觀察5種補(bǔ)益方對環(huán)磷酰胺毒性的拮抗作用。其可能機(jī)理是:①減輕了環(huán)磷酰胺對骨髓細(xì)胞染色體和DNA的損傷、加強(qiáng)了DNA損傷的修復(fù)能力以及逆轉(zhuǎn)環(huán)磷酰胺對骨髓細(xì)胞增殖周期的抑制,保護(hù)骨髓細(xì)胞不受損傷、破碎,促進(jìn)骨髓細(xì)胞的增殖分化,保證有充足的骨髓細(xì)胞發(fā)育成熟,進(jìn)入血液循環(huán),從而拮抗環(huán)磷酰胺對骨髓造