紅芪替換補(bǔ)中黃芪對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能的影響

紅芪替換補(bǔ)中黃芪對(duì)免疫抑制小鼠免疫功能的影響

紅仁是薔薇科巖石黃鼠尾科的干燥根。它的皮膚是紅棕色的。它與黃鼠尾科的其他物種（radixastagali）一起形成。兩者均具有補(bǔ)氣固表、益氣利尿、托毒排膿、斂瘡生肌等功效,臨床常將兩者等同而視,廣泛應(yīng)用于治療和養(yǎng)生保健。而1985年版中國(guó)藥典開(kāi)始將紅芪單列為一種中藥品種,對(duì)紅芪與黃芪的比較研究逐漸增多。發(fā)現(xiàn)兩者在成分、效用方面有區(qū)別,同時(shí)有報(bào)道發(fā)現(xiàn)在免疫調(diào)節(jié)方面也存在差異,這些發(fā)現(xiàn)推動(dòng)了紅芪在臨床上的應(yīng)用。而復(fù)方是中醫(yī)防治疾病的主要臨床應(yīng)用形式,目前尚缺乏對(duì)紅芪與黃芪在經(jīng)典方劑中的藥效對(duì)比研究。為此,本文選擇了2010年中華人民共和國(guó)藥典中以黃芪作為君藥,具有免疫調(diào)節(jié)作用的經(jīng)典補(bǔ)益方劑——益氣養(yǎng)血口服液和補(bǔ)中益氣口服液作為研究對(duì)象,以相同劑量的紅芪替換黃芪,比較其免疫調(diào)節(jié)作用的異同,為合理開(kāi)發(fā)紅芪的藥用價(jià)值和推廣應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。1材料表面1.1醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供昆明種小鼠60只,雌雄各半,體重18～22g,蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,合格證號(hào):SCXK(甘)2009-0004。K562細(xì)胞株由蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。1.2紅治療小鼠的相關(guān)水提物的制備中藥材購(gòu)于蘭州市藥材市場(chǎng),經(jīng)蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合研究所程衛(wèi)東教授鑒定合格;參照2010年中華人民共和國(guó)藥典,配制補(bǔ)中益氣方劑和益氣養(yǎng)血方劑;同時(shí)用相同劑量的紅芪替換復(fù)方中的黃芪配成相應(yīng)用紅芪的補(bǔ)中益氣和益氣養(yǎng)血方劑。以上各方均按照文獻(xiàn)通過(guò)體表面積換算為小鼠的劑量。各組相應(yīng)水提物制備嚴(yán)格按照藥典所述方法進(jìn)行煎制,將藥物濃縮為1g/mL,其中補(bǔ)中益氣各組水提物劑量為4g/(kg·d),益氣養(yǎng)血各組水提物劑量為6g/(kg·d),放置冰箱冷藏備用。環(huán)磷酰胺(CY)粉針劑(國(guó)藥準(zhǔn)字H31021703)為上海華聯(lián)制藥公司產(chǎn)品,用生理鹽水溶解,配制所需濃度。1.3elisa試驗(yàn)劑EZ-SepTMMOUSE1X淋巴細(xì)胞分離液、小鼠白細(xì)胞介素-4(IL-4)、γ-干擾素(IFN-γ)ELISA試劑盒(深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司);FITC-抗小鼠CD3、PE/Cy5-抗小鼠CD4、PE-抗小鼠CD8、PerCP-抗小鼠CD19單克隆抗體(Biolegend公司);680型酶聯(lián)儀(美國(guó)BIO-RAD公司);超純水機(jī)(艾科浦,型號(hào)AF2-0502-U);流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼COULTER公司)。2方法2.1免疫抑制大鼠模型的建立小鼠腹腔注射CY50mg/(kg·d),連續(xù)7d,制備免疫抑制小鼠模型。2.2各組大鼠血清中益氣養(yǎng)血、用紅楸益氣養(yǎng)血組1例將60只小鼠隨機(jī)分為6組:對(duì)照組、模型組、補(bǔ)中益氣組、用紅芪補(bǔ)中益氣組、益氣養(yǎng)血組、用紅芪益氣養(yǎng)血組,每組10只。對(duì)照組給予0.9%鹽水,各中藥組分別于給予CY同時(shí)按4g或6g(kg·d)給藥,灌胃量均為0.02mL/g,1次/d,連續(xù)14d。2.3小鼠尾腺指數(shù)、脾指數(shù)測(cè)定末次給藥后次日,用電子天平精確稱取小鼠體重,眼球取血處死,無(wú)菌摘取小鼠胸腺、脾臟稱重,分別計(jì)算胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)。計(jì)算公式:胸腺指數(shù)或脾指數(shù)=胸腺或脾臟質(zhì)量(mg)/體重(g)。2.4分析胰腺中的細(xì)胞分離按EZ-SepTMMOUSE1X淋巴細(xì)胞分離液說(shuō)明書(shū)操作:在35mm培養(yǎng)皿中加入4mLEZ-SepTMMOUSE1X淋巴細(xì)胞分離液,將200目尼龍網(wǎng)鋪于培養(yǎng)皿上。取脾臟置于尼龍網(wǎng)上面,研壓脾臟,使其成為分散的單個(gè)細(xì)胞。將含有脾細(xì)胞的淋巴細(xì)胞分離液立即轉(zhuǎn)移到15mL離心管,再加入200μL1640培養(yǎng)液,形成界面。2000r/min離心30min,吸出淋巴細(xì)胞于15mL離心管,再加入10mL1640培養(yǎng)液,混勻,1000r/min離心10min,棄上清,加入1mL1640培養(yǎng)液。細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整為所需細(xì)胞濃度。2.5細(xì)胞調(diào)干試驗(yàn)按2.4方法制備細(xì)胞濃度為1×1012L-1的脾細(xì)胞懸液,分別取細(xì)胞懸液100μL,加FITC-抗小鼠CD31μL、Percp-抗小鼠CD191.25μL,或FITC-抗小鼠CD31μL、PE/Cy5-抗小鼠CD41.25μL、PE-抗小鼠CD81.25μL,輕輕旋轉(zhuǎn)混合,4℃冰箱避光孵育30min,PBS洗細(xì)胞1次,2300r/min離心5min,棄上清,細(xì)胞沉淀內(nèi)加500μLPBS,混勻,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。2.6血清收集血清各組小鼠眼眶靜脈叢采血,自然凝固,放置3h,使血清充分析出,1500r/min離心10min,收集血清。用生理鹽水將血清稀釋10倍,用ELISA法檢測(cè)血清IL-4、IFN-γ的含量,操作步驟嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,檢測(cè)結(jié)果經(jīng)酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)測(cè)定OD值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以mg/L為單位,計(jì)算其含量。2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,組間比較采用LSD-t檢驗(yàn),計(jì)量資料采用ˉx±s表示,以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3結(jié)果3.1中醫(yī)藥組對(duì)免疫抑制大鼠器官指數(shù)的影響結(jié)果見(jiàn)表1。3.2中醫(yī)藥組對(duì)免疫抑制大鼠淋巴結(jié)亞組的影響結(jié)果見(jiàn)表2。3.3各組對(duì)血清il-4和ifn-4含量的影響結(jié)果見(jiàn)表3。4不同對(duì)紅治療的對(duì)免疫調(diào)節(jié)的作用傳統(tǒng)認(rèn)為紅芪與黃芪性味歸經(jīng)和功效相似,而經(jīng)常等同使用。但兩者不僅外觀區(qū)別明顯,在化學(xué)成分的含量和類型等方面也明顯不同,尤其在皂苷類差異更大。中藥復(fù)方通過(guò)君臣佐使的協(xié)調(diào)配合,以增強(qiáng)療效,減少毒副作用,體現(xiàn)了中醫(yī)辨證論治的特色優(yōu)勢(shì)。所以,通過(guò)研究用紅芪和用黃芪的補(bǔ)益方劑對(duì)免疫功能的調(diào)節(jié)作用,可進(jìn)而探討黃芪和紅芪免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)的異同。補(bǔ)中益氣和益氣養(yǎng)血方劑均為以黃芪為君藥的經(jīng)典補(bǔ)益方劑,具有確定的免疫調(diào)節(jié)作用。選擇這2個(gè)方劑為研究對(duì)象,觀察其用紅芪和用黃芪之不同配伍的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng),具有較好的代表性。在采用環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)建立免疫抑制動(dòng)物模型基礎(chǔ)上,分別給予用紅芪和用黃芪的經(jīng)典補(bǔ)益劑進(jìn)行干預(yù)和研究。結(jié)果表明,用黃芪和用紅芪的補(bǔ)中益氣和益氣養(yǎng)血水提物均能保護(hù)和改善胸腺和脾臟器官,調(diào)節(jié)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的脾臟中T、B細(xì)胞亞群的失衡,恢復(fù)T、B淋巴細(xì)胞亞群的正常比例,表明在所選的經(jīng)典補(bǔ)益劑中,以等量紅芪替換黃芪作為君藥進(jìn)行對(duì)比,顯示出相似的免疫調(diào)節(jié)作用。同時(shí)在恢復(fù)脾臟免疫狀態(tài)、提高CD3+T淋巴細(xì)胞總數(shù)百分比和血清