固相法合成活性多肽的研究進(jìn)展

固相法合成活性多肽的研究進(jìn)展

氨基酸是生物中常見的氨基酸成分。到目前為止，已經(jīng)在生物中發(fā)現(xiàn)了數(shù)萬(wàn)種氨基酸。由于其廣泛的生物活性和良好的安全性，藥物研究人員越來(lái)越受到重視。尤其在20世紀(jì)90年代以后,隨著多肽合成技術(shù)的日臻成熟,越來(lái)越多的活性多肽已被開發(fā)并廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品、農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)等領(lǐng)域。1液相合成多肽由于活性多肽類物質(zhì)的重要性,合成這些活性物質(zhì)就成了生物化學(xué)家研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。而多肽的合成主要是指化學(xué)合成法,其中液相合成和固相合成是最主要的合成方法。液相合成多肽主要有逐步合成和分段合成兩種途徑。液相法在多肽的工業(yè)化生產(chǎn)方面有非常重要的應(yīng)用。固相合成法在20世紀(jì)60年代被提出,與經(jīng)典的液相合成多肽方法相比,由于固相合成大大簡(jiǎn)化了后處理操作步驟,可以得到較高的收率和產(chǎn)物純度,易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn),近幾十年來(lái)在合成活性多肽類物質(zhì)方面得到了極大的發(fā)展與應(yīng)用。2solid最佳條件1963年Merrifield提出固相多肽合成方法(SPPS,SolidPhasePeptideSynthesis),為多肽研究開辟了廣闊的天地,并極大地推動(dòng)了分子生物學(xué)等領(lǐng)域的發(fā)展,為此1984年Merrifield被授予了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。2.1產(chǎn)物的活性化合物多肽合成是一個(gè)重復(fù)添加氨基酸的過(guò)程,合成一般從C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。首先將目的肽第一個(gè)氨基酸的羧基以共價(jià)鍵的形式與固相載體相連,再以這一氨基酸的氨基為合成起點(diǎn),經(jīng)過(guò)脫去氨基保護(hù)基并同過(guò)量的活化的第二個(gè)氨基酸反應(yīng),接長(zhǎng)肽鏈。重復(fù)(縮合→洗滌→去保護(hù)→中和及洗滌→下一輪縮合)操作,達(dá)到所要合成的肽鏈長(zhǎng)度,最后將肽鏈從樹脂上裂解下來(lái),經(jīng)過(guò)純化等處理,即得所要的多肽。2.2合成方法目前固相合成多肽主要有兩種方法:一是叔丁氧碳基合成法(Boc合成法);二是9-甲氧羥基合成法(Fmoc合成法)。2.2.1目標(biāo)多肽的合成采用三氟乙酸(TFA)可脫除的Boc為α-氨基保護(hù)基,側(cè)鏈保護(hù)采用芐醇類。合成時(shí)將一個(gè)Boc保護(hù)的α-氨基酸共價(jià)交聯(lián)到樹脂上,用TFA脫除Boc,三乙胺中和游離的氨基末端,然后通過(guò)DCC活化、偶聯(lián)下一個(gè)氨基酸,最終采用強(qiáng)酸HF法或三氟甲磺酸(TFMSA)將合成的目標(biāo)多肽從樹脂上解離。在Boc合成法中,由于要反復(fù)地用酸來(lái)脫保護(hù)以便進(jìn)行下一步的偶聯(lián),這就引入了一些副反應(yīng),如多肽容易從樹脂上切除下來(lái),氨基酸側(cè)鏈在酸性條件不穩(wěn)定并發(fā)生副反應(yīng)。2.2.2fmoc側(cè)鏈采用堿脫除的foc保護(hù)1978年,Meienlofer和Atherton等人發(fā)展了以Fmoc(9-芴甲氧羰基)基團(tuán)作為α-氨基保護(hù)基的多肽合成方法—Fmoc法。在Fmoc法中,采用了可被堿脫除的Fmoc作為α-氨基酸的保護(hù)基,側(cè)鏈采用酸脫除的Boc保護(hù)方法。Fmoc作為氨基保護(hù)基的優(yōu)點(diǎn)在于它對(duì)酸穩(wěn)定,用TFA等試劑處理不受影響,僅需用溫和的堿處理,側(cè)鏈用對(duì)堿穩(wěn)定的Boc進(jìn)行保護(hù)等。肽段最后用TFA/二氧甲烷(DCM)定量地從樹脂上切除,避免了采用強(qiáng)酸。Fmoc法與Boc法相比,由于Fmoc法反應(yīng)條件溫和,副反應(yīng)少,產(chǎn)率高,而被廣泛應(yīng)用于多肽合成中。2.3固相合成聚合物的載體與化合物相關(guān)分子2.3.1氨基酸肽鏈或反應(yīng)團(tuán)將固相合成與其他多肽合成技術(shù)分開來(lái)的最主要的特征是固相載體,而能被用作多肽固相載體的聚合物必須滿足以下條件:(1)必須包含合適的連接分子(或反應(yīng)基團(tuán)),使肽鏈能連接在載體上面,并在以后除去。(2)必須在合成過(guò)程中保持穩(wěn)定并且不與氨基酸分子反應(yīng)。(3)必須提供足夠的連接點(diǎn),以滿足肽鏈的不斷增長(zhǎng)的需要。目前用于固相合成的聚合物載體主要有三類:聚苯乙烯-苯二乙烯交聯(lián)樹脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯—乙二醇類樹脂及衍生物。這些聚合物載體只有引入相應(yīng)的連接分子,才能與氨基酸進(jìn)行連接。根據(jù)連接分子的不同,樹脂又被分為幾種類型:氯甲基樹脂、羧基樹脂、氨基樹脂或酰肼型樹脂。2.3.2目標(biāo)分子的合成一個(gè)理想的連接分子必須在整個(gè)合成過(guò)程中十分穩(wěn)定,并在合成后可以定量的切割下來(lái)而又不破壞合成的目標(biāo)分子,同時(shí)連接分子還需要根據(jù)與樹脂相連的肽的C端的結(jié)構(gòu)類型,裂解后生成的羧酸、酰胺或氨基醇等衍生物來(lái)選擇。固相多肽合成使用過(guò)的連接分子為含有氯甲基、巰甲基、酰氯基、對(duì)苯甲酰基、芳磺酰氯基、烯丙醇基、丁二酰基、鄰硝基芐醇基及二苯氯硅烷等的雙官能團(tuán)化合物。2.4碳二亞胺類縮乳劑固相中肽鍵的形成原理與液相中的基本一致,應(yīng)用的方法主要有縮合劑法、混合酸酐法、酰氯法、活化酯法和原位法等,其中選用DCC、HOBT或HOBT/DCC的對(duì)稱酸酐法、活化酯法由于在肽鍵的形成過(guò)程中可以減少副反應(yīng)并抑制消旋的發(fā)生,最終得到的多肽收率高等優(yōu)點(diǎn)而應(yīng)用最廣。近幾十年,隨著多肽合成研究的逐步深入,越來(lái)越多的肽鍵縮合劑被設(shè)計(jì)出來(lái)(如見圖2所示)。DCC、DIC等碳二亞胺類縮合劑,正被更高效的HBTU、BOP、HATU這類脲陽(yáng)離子和磷正離子的HOBt或HOAt縮合體系取代。這類縮合劑的優(yōu)點(diǎn)在于克服了DCC在反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生沉淀的缺點(diǎn),而且縮合效率明顯提高,副反應(yīng)少,出現(xiàn)的副產(chǎn)物也容易被洗滌出接肽反應(yīng)體系,且合成目的肽的光學(xué)純度高。特別是隨著Fmoc多肽合成法的發(fā)現(xiàn)及發(fā)展,其縮合劑多采用TBTU、HOBt、DIEA,這種縮合劑體系明顯縮短了接肽反應(yīng)時(shí)間,減少了副反應(yīng),抑制了消旋現(xiàn)象的發(fā)生。這些新型的縮合劑及其體系正被應(yīng)用到更多的合成多肽的反應(yīng)當(dāng)中。2.5tfa法研磨法按既定的順序合成完多肽后,就要把目標(biāo)多肽從樹脂上切割下來(lái),并進(jìn)行進(jìn)一步的純化。由于多肽的合成有Boc法和Fmoc法兩種,因此,它們的切割方法也不完全一樣。在Boc法中,主要用TFA+HF裂解和脫側(cè)鏈保護(hù)。在Fmoc法中直接用TFA進(jìn)行切割。以Fmoc法的切割為例,首先將反應(yīng)的樹脂用二氯甲烷洗滌幾遍后,真空抽干。往裝有樹脂的多肽固相反應(yīng)器中緩慢加入:三氟乙酸/三異丙基硅烷/水(TFA/TIS/H2O)=95/2.5/2.5(體積比)溶液,反應(yīng)3h,過(guò)濾,氮?dú)獯等ゴ蟛糠值娜軇┖?向殘液中倒入預(yù)先冷凍的無(wú)水乙醚,離心,倒去上層溶劑乙醚,向沉淀中再次加入無(wú)水乙醚,振蕩,離心,再重復(fù)一次,除去大部分的雜質(zhì)。將得到的沉淀真空干燥24h。固體殘留物用離子水溶解,冷凍干燥得到白色絮狀固體,-20℃保存。2.6粗品多肽的制備合成肽鏈進(jìn)一步的精制、分離與純化通常采用高效液相色譜、親和層析、毛細(xì)管電泳等。目前應(yīng)用最多的是高效液相色譜法,其具體的步驟:將凍干的粗品多肽,溶于20%乙腈/水溶液,用含有0.6%TFA的乙腈/水溶液進(jìn)行梯度洗脫,收集主要峰產(chǎn)物,減壓旋蒸除去乙腈,在冷凍干燥機(jī)上冷凍干燥,將目標(biāo)多肽產(chǎn)品放在-20℃保存。3在生物活性技術(shù)及分類上的應(yīng)用問(wèn)題由于多肽類藥物在治療某些疾病方面具有獨(dú)特的療效,因此,近幾十年來(lái)已經(jīng)引起越來(lái)越多的生物化學(xué)家和醫(yī)學(xué)家的關(guān)注。隨著多肽固相合成的提出和發(fā)展,人們可以相對(duì)簡(jiǎn)單地用設(shè)計(jì)合成的多肽分子來(lái)進(jìn)行生物活性的研究等工