蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進展

蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進展

眾所周知，自20世紀(jì)90年代初以來，巨大的人類組織計劃取得了巨大的成功。10多個低等模式生物的基因組序列測定已經(jīng)完成:第一個多細胞生物——線蟲基因組的DNA全序列測定在1998年底完成;人類基因組序列草圖已經(jīng)繪制完成。但是,由于基因的主要功能是通過其表達產(chǎn)物——蛋白質(zhì)來實現(xiàn)的,因此人類要揭示整個生命活動的規(guī)律,就必須研究基因的產(chǎn)物——蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)具有自身特有的活動規(guī)律,隨著生命活動的進程表現(xiàn)出極其動態(tài)的緊密協(xié)調(diào)的變化,蛋白質(zhì)在合成之后具有相對獨立的修飾、轉(zhuǎn)運和相互間作用能力,同時還具有對外界因素發(fā)生反應(yīng)的能力。因此,只有從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度對所有蛋白質(zhì)的總和進行研究,即開展蛋白質(zhì)組學(xué)研究,才能更加貼近對生命現(xiàn)象和本質(zhì)的掌握,生命活動的本質(zhì)和活動規(guī)律才能找到答案。1蛋白質(zhì)組學(xué)研究理論蛋白質(zhì)組(Proteome)指由基因組編碼的全部蛋白質(zhì),也可以說是指細胞或組織或機體全部蛋白質(zhì)的存在及其活動方式。蛋白質(zhì)組學(xué)旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達模式及功能模式,其內(nèi)容包括鑒定蛋白質(zhì)的表達、存在的方式(修飾形式)、結(jié)構(gòu)、功能和相互作用等。從蛋白質(zhì)組的定義上可以清楚地看出,蛋白質(zhì)組學(xué)不同于傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)學(xué)科之處在于它的研究是在生物體或其細胞的整體蛋白質(zhì)水平上進行的,它是從一個機體或一個細胞的蛋白質(zhì)整體活動的角度來解釋和闡明生命活動的基本規(guī)律。蛋白質(zhì)組研究可分為兩個方面:一方面是對蛋白質(zhì)表達模式(或蛋白質(zhì)組組成)的研究;另一方面是對蛋白質(zhì)組功能模式(目前主要集中在蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系)的研究。對蛋白質(zhì)組組成的分析鑒定是蛋白質(zhì)組學(xué)中與基因組學(xué)相對應(yīng)的主要內(nèi)容。它要求對蛋白質(zhì)組進行表征,即實現(xiàn)亞細胞結(jié)構(gòu)、細胞或組織等不同生命結(jié)構(gòu)層次中所有蛋白質(zhì)的分離、鑒定及其圖譜化。此外,尚須比較、分析在發(fā)生變化的生理條件下蛋白質(zhì)組所發(fā)生的變化。如蛋白質(zhì)表達量的變化,翻譯后修飾的類型和程度,或者可能的條件下分析蛋白質(zhì)在亞細胞水平上定位的改變等。雙向凝膠電泳(2-DE)和質(zhì)譜(MS)技術(shù)是當(dāng)前分離鑒定蛋白質(zhì)的兩大支柱技術(shù)。通過分析一個蛋白質(zhì)是否與有抑制功能的蛋白質(zhì)相互作用可得到揭示其功能的線索。利用大規(guī)模酵母雙雜交系統(tǒng),建立相互作用關(guān)系的網(wǎng)絡(luò)圖,是目前蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一。2關(guān)于蛋白質(zhì)的科學(xué)研究2.1凝膠電泳和圖像分析目前在蛋白質(zhì)組研究中應(yīng)用最多的是二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE),它也是目前對蛋白質(zhì)組分辨率最高、重復(fù)性最好的分離技術(shù)。二維聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點和分子量大小不同,進行兩次電泳將之分離。二維電泳的第一向是等電聚焦(isoelectricfocusing,IEF),分為載體兩性電解質(zhì)pH梯度等電聚焦和固相化pH梯度等電聚焦。其第二向是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS),一般采用垂直電泳或水平電泳。兩種方法的實驗結(jié)果沒有明顯的差別,均適用于分子質(zhì)量在10~150Ku的蛋白質(zhì)。由于2-DE利用了蛋白質(zhì)兩個彼此不相關(guān)的重要性質(zhì)對其進行分離,因此分辨率非常高,一般能分辨到1000~3000個蛋白質(zhì)樣點。最好的膠可分離得到11000個左右的蛋白質(zhì)樣點。但這與龐大的蛋白質(zhì)組組分相比遠遠不能滿足需要,因此,樣品的制備和發(fā)展預(yù)分離方法將是很有用的。二維電泳分離后的蛋白質(zhì)點經(jīng)顯色后才能被鑒定。二維電泳中的顯色是一個重要的步驟,常用的顯色方法有考馬斯亮藍染色、銀染、熒光染色或同位素標(biāo)記等。其中,銀染法是非放射性染色方法中最靈敏的,其靈敏度可達到1ng甚至更低。但最靈敏的還是利用同位素標(biāo)記,20ppm的標(biāo)記蛋白就可通過其熒光或磷光的強度而測定。圖像分析也是二維電泳研究的重要方面。染色后可用圖像掃描儀、激光光密度儀、磷光或熒光測定儀等建立雙向凝膠電泳圖譜。此外,還要對不同組織、不同細胞表達的蛋白質(zhì)圖譜進行比較,除掉凝膠圖譜的紋理和背景,找到表達上差異的蛋白質(zhì)點,確定有生物意義的蛋白質(zhì)。近來又出現(xiàn)了一些新的蛋白質(zhì)分離技術(shù),如多維色譜技術(shù)、親和色譜技術(shù)和一維變性聚丙烯酰胺凝膠電泳等,其中最有發(fā)展前景的是多維色譜技術(shù)。從目前的發(fā)展方向看,液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用成為蛋白質(zhì)組學(xué)分離技術(shù)的一個新的增長點,并越來越受到關(guān)注。該技術(shù)最突出的優(yōu)點是對全蛋白質(zhì)組分進行分析時的歧視效應(yīng)大大減小,而且可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)分離與鑒定的在線聯(lián)用,有利于蛋白質(zhì)組研究的自動化和高通量化。2.2蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)2.2.1降解蛋白組活性成分的測序和速度分布由于Edman降解法測序可得到準(zhǔn)確的肽序列,是蛋白質(zhì)鑒定可靠的重要依據(jù),因而成為目前蛋白質(zhì)鑒定的主要方法。但它存在著測序速度較慢、費用偏高等缺陷。最近,應(yīng)用細徑(內(nèi)徑0.8mm,流速40μl/min)的HPLC柱,Cordwell等能夠在100飛摩爾(fmol)的初產(chǎn)率下測得5~10個氨基酸殘基的序列。隨著Edman降解法在微量測序和速度等技術(shù)上的突破,它在蛋白質(zhì)組研究中可發(fā)揮重要的作用。類似Edman的C端化學(xué)降解法已研究了多年并有自動化分析儀器問世,但它的反應(yīng)效率較低,通常需納摩爾(nmol)樣品。2.2.2電離子質(zhì)譜的發(fā)展質(zhì)譜技術(shù)的基本原理是帶電粒子在磁場或電場中運動的軌跡和速度依粒子的質(zhì)量與攜帶電荷比(質(zhì)荷比m/z)的不同而變化,從而可以據(jù)其來判斷粒子的質(zhì)量和特性。質(zhì)譜儀一般有進樣裝置、離子化源、質(zhì)量分析器、離子檢測器和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)組成。質(zhì)譜最重要的技術(shù)是將被分析的分子變成氣相的離子。質(zhì)譜技術(shù)按照樣品分子離子化的方式分為電噴霧離子化質(zhì)譜(electrosprayionizationmassspectrometry,ESI-MS)和基質(zhì)輔助的激光解吸離子質(zhì)譜(matrixassistedlasterdesorptionionizationmassspectrometry,MALDI-MS)。在離子化方面,兩種質(zhì)譜都采用“軟電離”的方法,即樣品分子電離時,保留整個分子的完整性,不會形成碎片離子。這對以前的電子電離方式是一個很大的突破,因為電子電離方式的樣品分子必須氣化,并與電子直接碰撞,而對于大分子,特別是熱不穩(wěn)定、極性的蛋白質(zhì)而言,這種電離方式會產(chǎn)生大量的碎片離子,結(jié)果圖譜譜線多得無法分析。這就是質(zhì)譜技術(shù)出現(xiàn)已久,但沒能應(yīng)用到生物大分子研究的主要原因。因此,當(dāng)80年代Fenn第一次展示電噴霧離子化圖譜時,就引起了轟動。不久,MALDI電離技術(shù)也發(fā)展起來了。到90年代初,ESI和MALDI已被認(rèn)為是兩種在生物大分子研究中具有重要意義的離子化技術(shù)。另外,對于蛋白質(zhì)和多肽,質(zhì)譜技術(shù)還有一個重要功能就是多肽的測序,即采用串聯(lián)質(zhì)譜(Tandem-MS),在第一級質(zhì)譜得到多肽的分子離子,選取目標(biāo)多肽的離子作為母離子,與惰性氣體碰撞,使肽鏈中的肽鍵斷裂,形成一系列的離子,即N端碎片離子系列(B系列)和C端碎片離子系列(Y系列),將這些碎片離子系列綜合分析,可得出多肽片段的氨基酸序列。Wilm等應(yīng)用納噴串聯(lián)質(zhì)譜(nano-electrospraytandemmassspectrometry)能在較低的飛摩爾上測得多肽片段序列。質(zhì)譜法有不少優(yōu)點,還能用于翻譯后修飾的分析(糖基化、磷酰化),但目前只適用于20個氨基酸以下的多肽片段。此外,它還存在固有的局限性,譬如Leu和Ile、Lys和Gln不能區(qū)別,有些多肽的固有序列不能用質(zhì)譜法測定。2.2.3蛋白的分離和測定氨基酸組成分析由于耗資低而常用于蛋白質(zhì)鑒定。氨基酸組成分析有別于肽質(zhì)量或序列標(biāo)簽,是利用不同蛋白質(zhì)具有特定的氨基酸組份的特征來鑒定蛋白質(zhì)。該法可用于鑒定2-DE分離的蛋白質(zhì),應(yīng)用放射標(biāo)記的氨基酸來測定蛋白質(zhì)的氨基酸組份,或?qū)⒌鞍踪|(zhì)轉(zhuǎn)PVDF膜,在155℃酸性水解,讓氨基酸自動衍生后,經(jīng)色譜分離,獲得的數(shù)據(jù)用AACompIdent、ASA、AAC-P1、PROP-SEARCH等軟件進行數(shù)據(jù)庫查詢,依據(jù)代表兩組分間數(shù)目差異的分?jǐn)?shù)對數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)進行排榜,“冠軍”蛋白質(zhì)的可信度較大。但該法的速度較慢,所需蛋白質(zhì)或肽的量較大,在超微量分析中受到限制;且存在酸性水解不徹底或部分降解而產(chǎn)生氨基酸變異的缺點,故應(yīng)結(jié)合蛋白質(zhì)的其它屬性進行鑒定。2.2.4生物表面檢測蛋白質(zhì)芯片(ProteinChip)技術(shù)是繼基因芯片(GeneChip)技術(shù)之后的新一代生物芯片技術(shù)。根據(jù)芯片表面的不同化學(xué)成分,可將蛋白質(zhì)芯片分為化學(xué)表面芯片和生物表面芯片。其中化學(xué)表面芯片又可分為疏水、親水、陽離子、強陰離子和金屬離子螯合芯片五種,用于檢測未知蛋白,并獲取指紋圖譜。生物表面分為抗體抗原、受體配體和DNA蛋白質(zhì)芯片等種類,可顯示與之結(jié)合的抗原或配體的不同分子量亞型。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是一種高通量、微型化和自動化的蛋白質(zhì)分析技術(shù),它不需要進行蛋白質(zhì)分離,只是利用抗體或其它類型親和探針構(gòu)成的芯片進行檢測,可以同時檢測幾千種蛋白質(zhì),效率非常高。具體方法是首先將一系列的“誘餌”(Bait)蛋白質(zhì)(如抗體)按照一定的排列格式固定在經(jīng)特殊處理的材料表面上。然后以我們感興趣的樣品為探針來探查該表面,那些與相應(yīng)的抗體相結(jié)合的蛋白質(zhì)就會被吸附在表面上。而后把未與抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)洗掉,把結(jié)合的蛋白質(zhì)洗脫下來,經(jīng)凝膠電泳之后通過質(zhì)譜法進行鑒定。這種技術(shù)實際上是一種大規(guī)模的酶聯(lián)免疫分析,可以迅速地將我們感興趣的蛋白質(zhì)從混合物中分離出來,并進行分析。蛋白質(zhì)芯片上的“誘餌”蛋白質(zhì)可根據(jù)研究目的不同,選用抗體、抗原、受體、酶等具有生物活性的蛋白質(zhì)。2.3蛋白質(zhì)組學(xué)研究內(nèi)容蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用是細胞生命活動的基礎(chǔ)和特征。這種千變?nèi)f化的相互作用以及由此形成的紛雜的蛋白質(zhì)聯(lián)系網(wǎng)絡(luò)同樣也是蛋白質(zhì)組學(xué)的研究內(nèi)容,且相應(yīng)的工作也已經(jīng)展開。目前的研究方法主要有酵母雙雜交系統(tǒng)、表面等離子共振技術(shù)等。2.3.1轉(zhuǎn)錄激活因子酵母雙雜交系統(tǒng)(yeasttwohybridsystem)自Fields和Song建立以來已經(jīng)成為分析蛋白質(zhì)相互作用的強有力的方法。該方法仍在不斷的完善中,如今它不但可用來在體內(nèi)檢驗蛋白質(zhì)間、蛋白質(zhì)與小分子肽、蛋白質(zhì)與DNA、蛋白質(zhì)與RNA間的相互作用,而且還能用來發(fā)現(xiàn)新的功能蛋白質(zhì)和研究蛋白質(zhì)的功能,在對蛋白質(zhì)組中特定的代謝途徑中的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識上發(fā)揮了重要的作用。酵母雙雜交系統(tǒng)的建立得益于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識。細胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式(modular),即這些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,其中DNA結(jié)合域(DNAbindingdomain,簡稱為DB)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activationdomain,簡稱為AD)是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。單獨的DB雖然能和啟動子結(jié)合,但是不能激活轉(zhuǎn)錄。而不同轉(zhuǎn)錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能。DB和AD分別能與多肽X和Y結(jié)合,由DB和AD形成的融合蛋白現(xiàn)在一般分別稱之為“誘餌”(bait)和“獵物”或“靶蛋白”(prey或targetprotein)。如果在X和Y之間存在相互作用,那么分別位于這兩個融合蛋白上的DB和AD就能形成有活性的轉(zhuǎn)錄激活因子,從而激活相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄與表達。這個被激活的、能顯示“誘餌”和“獵物”的兩個蛋白質(zhì)之間相互作用的基因稱之為報道基因(reportergene)。通過對報道基因表達產(chǎn)物的檢測,反過來可判別作為“誘餌”和“獵物”的兩個蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。酵母雙雜交技術(shù)只能反映蛋白質(zhì)間可能發(fā)生作用,還必須結(jié)合其它試驗才能確認(rèn),尤其是要與生理功能研究結(jié)合。雖然如此,該項技術(shù)在蛋白質(zhì)間的相互作用研究、篩選新的蛋白質(zhì)以及研究蛋白質(zhì)功能等方面仍發(fā)揮著重要的作用。2.3.2spr檢測原理目前,表面等離子體共振(SurfacePlasmonResonance)技術(shù)已成為了當(dāng)今一種全新的研究蛋白質(zhì)之間相互作用的手段。表面等離子體共振SPR生物傳感器是利用表面等離子體共振現(xiàn)象和SPR譜峰對金屬表面上電介質(zhì)變化敏感的特點,通過將受體蛋白固定在金屬膜上,檢測受體蛋白與液相中配體蛋白的特異性結(jié)合。SPR技術(shù)的特點是測定快速、安全、不需標(biāo)記物或染料及靈敏度高。其除了應(yīng)用于檢測蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用外,還可檢測蛋白質(zhì)與核酸及其他生物大分子之間的相互作用,并且能對整個反應(yīng)過程進行實時監(jiān)測。因此,SPR技術(shù)在檢測生物大分子特異性相互作用上比傳統(tǒng)的方法更具優(yōu)勢,其對基礎(chǔ)理論、醫(yī)學(xué)診斷及治療等都具有十分重要的意義。2.4生物組織學(xué)研究是基因組和蛋白質(zhì)組研究數(shù)據(jù)的一個重要研究概念,但同時進行部分基因生物信息學(xué)(bioinformatics)是在生命科學(xué)、計算機科學(xué)和數(shù)學(xué)的基礎(chǔ)上逐步發(fā)展而形成的一門新興交叉學(xué)科,是為理解各種數(shù)據(jù)的生物學(xué)意義,運用數(shù)學(xué)與計算機科學(xué)手段進行生物信息的收集、加工、存儲、傳播、分析與解析的科學(xué)。生物信息學(xué)在基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中起了特殊的重要作用,因為基因組和蛋白質(zhì)組研究提供的數(shù)據(jù)的數(shù)量之巨大在生物學(xué)史上是史無前例的。而且,蛋白質(zhì)組比基因組具有更大的復(fù)雜性,因而蛋白質(zhì)組信息學(xué)更有挑戰(zhàn)性。當(dāng)前生物信息學(xué)已經(jīng)不僅是高效地進行基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的分析,而且可以對已知或新的基因產(chǎn)物進行全面的功能分析。例如用生物信息學(xué)對質(zhì)譜得到的肽指紋圖譜(peptide-massfingerprinting)分析出了一個新的在進化過程中保守的模序(motif),它對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能具有重要意義。用分子建模(molecularm