乙型肝炎病毒免疫學研究進展

乙型肝炎病毒免疫學研究進展

中國是肝炎的高流行地區(qū)。感染肝炎病毒（hbv）可導致慢性肝炎、肝硬化和肝腫瘤。目前尚無特效藥物治療,而乙肝疫苗的廣泛應用可對乙肝病毒的流行起到非常重要的遏制作用。本文著重從免疫學方面闡述乙肝疫苗的近年研究進展以及未來研究方向。1乙肝病毒的一般介紹1.1hbv基因組中病毒編碼及鑒定乙肝基因組的結構是不等長的雙鏈DNA,長鏈為負鏈,短鏈為正鏈。HBV基因組中已確定的開放讀框有4個,分別編碼病毒的核殼(C)和包膜(S)蛋白,病毒復制酶(polymerase)及一種似乎與病毒基因表達有關的蛋白質X。1.2核心樣dna的合成當HBV的DNA進入宿主細胞后,首先成為完整的閉環(huán)雙螺旋DNA,以負鏈為模板合成全長的“+”鏈RNA(稱為前基因組RNA)。該“+”鏈RNA被包裝在未成熟的核心樣顆粒中,同時還有DNA聚合酶和一種蛋白質也被包裝在顆粒中。在該顆粒中,“+”鏈RNA作為模板由反轉錄酶催化合成“-”鏈DNA?！?”鏈DNA的合成便以該“-”鏈DNA為模板和一段RNA為引物而聚合延伸,核心樣病毒顆粒在這個過程中也成為成熟的病毒顆粒。這時,正鏈DNA仍沒有合成完畢,因而造成病毒基因組兩條DNA鏈長度不一樣。1.3細胞免疫和細胞復制作用HBV并不直接引起肝細胞的損傷,反而是機體的免疫病理反應是導致肝細胞損傷的主要因素。而免疫又分為細胞免疫和體液免疫。其中細胞免疫在去除病毒方面起到了重要作用。細胞免疫主要有三個方面:第一,由Th細胞分泌多種細胞因子,如白介素2(IL-2),通過促進T淋巴細胞(CTL)、自然殺傷細胞(NK)和巨噬細胞的活化和增殖來清除病毒;第二,CTL細胞內結構改變,分泌穿孔素、顆粒酶和淋巴毒素等直接殺傷靶細胞,或者CTL分泌腫瘤壞死因子(TNF-α)和γ干擾素(IFN-γ)降低病毒RNA的穩(wěn)定性,溶解病毒殼膜,抑制病毒復制;第三,CTL表面表達FasL蛋白,通過Fas途徑誘導細胞凋亡。1.4并發(fā)癥的預防乙肝病毒感染后有三種可能:(1)急性肝炎;(2)重癥肝炎,表現為急性肝壞死;(3)慢性肝炎或無癥狀攜帶者。其中急性肝炎可以基本上清除所有病毒并獲得對乙肝病毒的免疫力。重癥肝炎可因抗原抗體復合物沉積在肝臟血管而造成肝臟急性衰竭,死亡率高達90%。至于困擾醫(yī)學界多年的頑癥———慢性肝炎,其感染的危險性以新生兒最高。國外數據表明,對于母親HBsAg陽性的嬰兒,在圍產期有90%可感染HBV。嬰兒期感染后,90%以上經歷40年的時間可演變成肝硬化,50年發(fā)展成肝癌,25%~40%可因之死亡。在中國約有10%的孕婦是HBV攜帶者,所生的嬰兒中有60%在兩年內可感染上HBV。2乙肝疫苗和dna疫苗1982年美國首先投入使用血源疫苗,隨后,第二代乙肝疫苗——DNA重組疫苗在1986年產生,這兩種疫苗都被證明是安全且有效的。1991年,WHO推薦,乙肝疫苗應該被規(guī)劃入HBsAg陽性率高于8%的各國的全民免疫計劃中。截至2002年,154個國家已經將乙肝疫苗列入嬰兒的常規(guī)免疫中。上述兩種乙肝疫苗盡管非常安全有效,但是還有它們的一些弱點,所以DNA疫苗是現在乙肝疫苗發(fā)展的一個新方向。傳統(tǒng)的乙肝疫苗為蛋白疫苗,具有較強的免疫原性,可刺激機體產生高滴度的保護性抗體,但誘生的細胞免疫應答有限。DNA疫苗因其能誘生較強的特異性CD8+細胞應答,被考慮作為乙肝治療性疫苗。2.1小顆粒表面抗原1981美國研制出血源性疫苗,采用無癥狀帶毒者(HBsAg陽性)的血漿制備。血源性疫苗由于提取方法的不同,所得成分也會有所差別,但是均含有直徑22nm的乙肝小顆粒表面抗原。血源性疫苗曾對控制乙肝流行起到很大的作用,但仍存在以下不足:(1)隨著高危人群被免疫接種且病人多數不愿意提供血液而導致血源困難。(2)疫苗需經黑猩猩安全試驗,成本高,且實驗周期長達65周。(3)倘若滅活不徹底,有引起HIV和甲乙丙丁戊等肝炎傳播的危險。所以血源性疫苗只能是一個過渡階段。2.2多酚基因多肽疫苗又可分為預防性的多肽疫苗和治療性的多肽疫苗,現在應用較廣泛、技術較成熟的是預防性的多肽疫苗。2.2.1hbsag在細胞治療中的作用預防性多肽疫苗的主要成分是HBsAg。這種疫苗是很有效的預防疫苗,但還是有以下缺點:(1)抗-HBs并不是嚴格意義上的中和抗體,這就是說即使抗-HBs與HBsAg形成免疫復合物,還是不能阻止HBV通過其他的有效結合位點與肝細胞結合。(2)HBsAg的免疫原性并不是很強,也就是促成抗體生成的能力比較弱。近年研究發(fā)現,pre-S1、pre-S2(即為與S蛋白同時表達在毒粒表面的前S1、前S2表面蛋白)的免疫原性很強,所以出現了加入pre-S1、pre-S2的疫苗,這種疫苗也可以被用來做治療性疫苗。(3)由于HBsAg可以結合在單核巨噬細胞表面,并通過抑制內毒素(LPS)與抗原呈遞細胞表面的TLR(tolllikereceptor)的結合來抑制它們的活化,從而阻止炎癥反應的發(fā)生。這樣就不能促進機體產生強烈的免疫反應。2.2.1.免疫、免疫藥物的作用(1)疫苗的免疫原性不足,酵母和動物細胞不同來源的重組乙肝疫苗抗原由于表達系統(tǒng)不同、生產工藝不同及表面蛋白結構和糖基化程度不同,它們的免疫原性和免疫效果也不同。而且現有的乙肝疫苗大部分只含HBsAg,不如pre-S1和pre-S2的免疫原性強。(2)疫苗佐劑的不同也可引起免疫反應的不同。使用不同的佐劑能使乙肝疫苗具有不同的免疫效果。目前使用的乙肝疫苗基本上以氫氧化鋁作為佐劑。鋁佐劑能提高Th2型免疫反應,但不是對所有的人均有效,仍有部分人反應低下;鋁佐劑又可抑制Th1型免疫反應而不利于阻斷母嬰傳播。寡聚核苷酸(CpGODN)可與多種免疫細胞相作用,顯示出強大的佐劑效應,并能顯著提高抗體水平且效果與劑量成正比,與鋁佐劑也有協(xié)同作用,能同時誘導較強的Th1和Th2型免疫反應。另外以IL-2、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)作為佐劑也能大大提高效率。(3)過高劑量與過低劑量的疫苗都可引起T、B淋巴細胞免疫耐受而導致無或弱應答,而且過高劑量還可能增加不良反應。(4)不同接種途徑產生的效果有明顯不同。皮膚和肌肉內含有豐富的樹突狀細胞、淋巴細胞等免疫細胞,疫苗在皮內可停留較長時間,所以皮內注射可誘導較好的免疫應答。但皮內注射劑量小,一次只能注射0.1~0.2ml。所以一般認為肌肉注射效果比皮內注射好,但最近的研究發(fā)現,肌肉注射無應答者改用皮內注射后都可產生應答。(5)接種時間間隔和接種次數。追加針次可能使弱無應答者產生保護性抗體。(6)年齡、體重、性別等與機體免疫功能狀態(tài)有一定聯系。一般隨著年齡的增長,乙肝疫苗的應答率逐漸下降。另外有研究發(fā)現,重度肥胖者無或弱應答的危險是體重正常者的13.3倍。不同性別對乙肝疫苗的應答也有差異,一般認為女性抗體陽轉率和抗體滴度高于男性,但目前還不清楚原因。(7)低水平HBV感染者由于對HBsAg處于免疫耐受狀態(tài),因而對乙肝疫苗不應答。(8)主要組織相容性復合體(MHC)的多態(tài)性使MHC分子識別抗原時錨著位與錨著殘基結合的部位和結合力也可能不同,造成個體間對同一抗原的應答有所差別。國內外研究表明,乙肝疫苗無或弱應答與HLA-DR7、HLA-DRB1、D3、A1、B44、B8、SC01的高攜帶相關,與HLA-DR2、A10、CW4的低攜帶有關。(9)某些疾病如營養(yǎng)不良、HIV感染、腸道蠕蟲感染、使用免疫抑制劑、放射線治療及嗜煙酒等造成的免疫功能損害,或者早產兒免疫系統(tǒng)未發(fā)育成熟,使免疫細胞和免疫分子活性降低、數量減少或比例失調,引起對乙肝疫苗無或弱應答的發(fā)生。2.2.1.抗體結合性突變免疫逃逸是指抗-HBs無法與血液中的病毒粒結合,不能起到“中和”作用。主要原因是HB-sAg的結構發(fā)生了改變,使已接種疫苗者體內已有的保護性抗-HBs無法識別新侵入的病毒,無法執(zhí)行中和作用。此外還可能發(fā)生“診斷逃逸”,即已感染HBV病毒,但是檢測HBsAg陰性,這時就需要進行檢測HBVDNA。其具體機制:由于HBV的逆轉錄酶缺乏校正讀碼的功能,所以HBV呈現出比其他DNA病毒高十倍的突變率。實驗研究表明,使用乙肝病毒免疫球蛋白(HBIG)治療時,這種HBsAg突變體就會出現并逐漸成為優(yōu)勢病毒。而撤去HBIG后,這種突變體又回復到了野生型。并且核酸分析也顯示這種突變并不是隨機發(fā)生的,而是特定發(fā)生在抗體結合決定簇的部位。以上證據證實了這種突變是在免疫選擇壓力下發(fā)生的。圖1表示的是病毒表面HBsAg的a結合位點。我們知道盡管HBV有不同的亞型,但是它們都有共同的a抗原決定簇,所以疫苗才可以對不同的亞型都有效。從圖上可見,121~149位氨基酸就是抗-HBs結合的部位,由一大一小兩個“a”環(huán)組成,突變大部分發(fā)生在第二個“a”環(huán),也就是139~149的位置。而在第二個”a”環(huán)的氨基酸中,144、145是突變最為頻繁的。那么,為什么在疫苗免疫壓力下,病毒產生突變的頻率會升高?一些研究表明,由于HBsAg疫苗引起的免疫反應要比自然病毒感染引起的反應具有局限性,如果是急性感染就會發(fā)生強烈的多克隆特異性CTL,慢性病人的CTL反應則比較弱,以HBsAg為主成分的乙肝疫苗也不能引起多克隆的CTL,所以才會使病毒在有限的免疫步驟和狹窄的免疫范圍中找到生存之道。這也解釋了為什么在自然感染的HBV病人中很少發(fā)現有病毒突變體,而對母親HBV陽性的嬰兒接種時發(fā)現病毒變異體出現,尤其是在抗體結合位點發(fā)生突變的頻率大大增加。免疫逃逸的后果是比較嚴重的,如何評估HBsAg突變體帶來的影響呢?有沒有可能由于疫苗的大規(guī)模使用,導致在免疫壓力下病毒突變體成為了優(yōu)勢病毒株呢?這需要考慮流行病學、病毒的感染力、致病力以及疫苗交叉免疫的程度等因素。Wilson提出了一個理論模型來預測病毒突變株的未來。如果突變株具有很強的免疫交叉性,那么現有的疫苗就可以控制,突變株就不能成為威脅,但是如果出現了最悲觀的情況,也就是出現了交叉性為零的突變株,那么,由于疫苗廣泛應用導致感染野生株的人群比例下降,這樣為突變株占據主導地位開辟了道路。大概需要五十年,突變株可以占據主導地位。接種疫苗后還會有一個問題,那就是當抗體滴度下降后,還需要再次注射疫苗來維持滴度嗎?歐共體提出以下觀點:免疫完全的個體不需要在初次接種后再進行重復接種;在某些高危人群中,比如同性戀人群(MSM),可能需要重復接種來確保安全;對于免疫力低下的病人,當抗體滴度低于10mIU/ml時,推薦重復接種;對于首次接種弱或無應答者可以重復接種。但是也有國內外的意見認為還是需要重復接種的。2.2.2ctl誘導的檢測病毒特異性的CTL不但可以阻止慢性病毒感染的建立,而且可以在慢性感染建立之后驅除病毒。所以長時間來科學家們致力于研究如何在體內誘導出CTL反應。研究首先在動物體展開,比較常用的是小鼠。2.2.2.肽類疫苗的突破點:以mhc類分子為例由于MHCⅠ類分子的結合槽是需要特定的蛋白序列的,所以可以通過掃描肽段文庫來鑒定整個蛋白里面的MHCⅠ類分子結合部位,再通過免疫動物來檢查這些表位的免疫原性。最后得出有三種不同的肽段表位:(1)不與MHCⅠ類分子結合的表位。(2)隱蔽表位,就是當以整個蛋白為抗原時,不能與MHCⅠ類分子結合,但是如果單純以肽段形式為抗原時,就能與MHCⅠ類分子結合的表位。前兩種表位對于疫苗研究沒有意義。(3)能夠被呈遞的表位。這是對研究有意義的。這種有意義的表位包括主導表位和次主導表位。主導表位就是在蛋白表面大量高表達的表位。而且在CTL誘導反應中起主要作用,而次主導表位就是在APC表面呈遞量較少,CTL誘導作用較弱的表位。由于慢性乙肝的病因是由于T細胞的弱反應和耐受,又由于次主導表位在肝細胞表面的表達量較少,引起免疫耐受的可能性也較小,這樣尋找次主導表位來誘導CTL、打破免疫耐受成為研究肽類疫苗的一個突破點。但是還有兩個問題有待解決,一是肽類表位能否緊密有效地與MHC分子結合,因為與HLA-A2的親和力低于一定程度是不可能激發(fā)有效的CTL反應的。另一個問題是能否與MHC分子形成穩(wěn)定的復合物而不被泛素蛋白酶途徑降解。2.2.2.模型2:il-2和th-2對健康人群的作用CD4細胞除了誘導激活CD8細胞外還有其他的功能,比如在高滴度病毒感染時,能維持CD8細胞的濃度并防止其被耗盡,促使產生T記憶細胞。還有實驗表明,接受疫苗的無CD4的小鼠受到的免疫保護遠不如正常小鼠。這樣就可以得到結論:包含有Th細胞結合表位對于誘導CTL反應是有益的。但是需不需要把這兩個表位連接起來呢?實驗證明,連接的兩個表位比分別加入兩個表位要有效。進一步的實驗證明,加入IL-2和添加Th結合表位的效果一樣,也就是說Th發(fā)揮作用主要通過分泌IL-2來增強CTL反應。隨著對MHC認識研究的深入,人們能夠通過體外擴展技術來測定健康人群的CTL前體細胞數量。然后就不斷有人通過加入各種免疫佐劑和細胞因子來激發(fā)CTL反應,如上文中提到的CpGODN等。另外一種思路是有人發(fā)明了CY-1899,這是一個脂多肽,是將HBV核心抗原18-27與破傷風類毒素TT830-843模擬的Th細胞位點結合起來的疫苗,如果接種到正常人群中,引發(fā)的反應與直接感染病毒并清除干凈的CTL反應一樣,但是用來治療慢性乙肝病人的效果并不好,因為測得CTL反應強度只有急性乙肝病人消退期的十分之一。還有使用比TT830-843的抗原性強1000倍的PARDE作為誘導Th反應的位點,能大大提高應答率。另外還有人使用HBsAg-HBIG的抗原抗體復合物作為疫苗,也取得了較好的效果,但是制作過程非常復雜。所以多肽疫苗的研究還在持續(xù)進行著。2.2.2.il-15在疫苗方面的作用疫苗誘導細胞免疫的機制,CD4+細胞通過識別APC的MHCⅡ分子與T輔助細胞結合,同時CD40和CD40L結合能夠上調APC表達共刺激分子,如CD80/CD86,同時釋放細胞因子IL-12和IL-15,共刺激分子可與CD8+細胞的表面受體CD28結合,提供CTL活化的第二信號。IL-12也可促進活化CTL和極化T助細胞向Th1方向分化,并促進Th1分泌IFNγ等細胞因子。IL-15能夠誘導和維持CTL記憶細胞。至于調節(jié)性T細胞,如CD+25CD4+T細胞,由于它們可調控免疫,防止自身免疫和過度免疫反應的發(fā)生,因此也降低了疫苗的效果。我們可以提出一些針對多肽表位的策略來提高疫苗的效應:加入細胞因子,如IL-15(可強化T細胞記憶)、IL-12(可引導Th0細胞向Th1細胞分化);加入GM-CSF募集更多的DC細胞,或者通過表達更多共刺激配體(如CD40L)活化DC細胞;還可以利用含C-p-G的寡聚核苷酸刺激toll樣受體9(TLR9)以活化DC細胞?；蛘邚牧硪粋€方向考慮,我們可以封閉調節(jié)性T細胞釋放或誘導的細胞因子如IL-13和TGF-β,或者封閉抑制性受體,如CTLA-4,使CTL的作用達到最強。2.3hbcag在免疫疫苗中的應用DNA疫苗的原理就是將質粒直接注射,通過宿主體細胞所含的啟動子和增強子系統(tǒng)進行質粒DNA的調節(jié)表