具有抗腫瘤活性的海綿活性物質(zhì)的研究現(xiàn)狀

具有抗腫瘤活性的海綿活性物質(zhì)的研究現(xiàn)狀

目前，常見的化療和放療藥物往往會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用。因此，尋找高效、低毒腫瘤藥物是當(dāng)前熱點(diǎn)之一，而新型多醇藥物只是其特點(diǎn)。小分子多肽廣泛存在于自然界,并可通過人工方法合成,由于其具有相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)小、活性高、毒性低的特點(diǎn),在腫瘤的臨床治療上有重要的價(jià)值。本文按照來源將國(guó)內(nèi)外一些新的具有抗腫瘤活性的多肽的研究現(xiàn)狀予以綜述。1自然產(chǎn)物的多樣性1.1活性肽的制備海洋是生命之源,海洋生物物種占地球生物的80%以上,其中99%的物種尚未被利用,隨著現(xiàn)代生物技術(shù)和化學(xué)技術(shù)的應(yīng)用,近年來對(duì)海洋生物活性肽,特別是抗腫瘤活性肽的研究取得了很大進(jìn)展。1.1.1生物種類與海綿海綿(Marinesponge)是最原始的多細(xì)胞動(dòng)物,結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,無器官分化,約占海洋物種總量的1/15。在已公布的海綿活性物質(zhì)中,抗腫瘤活性肽較多。專利申請(qǐng)所涉及的海洋生物種類中,海綿一直居于首位。易楊華等從棕色扁海綿(PhakelliafuscaThiele)的乙醇提取物中獲得1個(gè)新的Phakellistatins類環(huán)肽化合物,為1個(gè)環(huán)狀七肽(Pro1-Gly-Phe-Pro2-Trp-Leu-Thr),該化合物具有抗腫瘤活性,其潛在的應(yīng)用前景正在評(píng)價(jià)之中,這是首次從產(chǎn)于我國(guó)海域的Phakellia屬海綿動(dòng)物中分離獲得此類化合物,對(duì)這些活性成分的研究為今后藥用資源的開發(fā)和新藥研究奠定了基礎(chǔ)。1.1.2環(huán)肽didennin活性及相關(guān)細(xì)胞周期作用海鞘(Ascidian)是接近脊索動(dòng)物門的高等無脊椎動(dòng)物,近年的研究表明,海鞘中含有許多重要的生理活性物質(zhì),是除海綿外人類獲取具有顯著生理活性物質(zhì)的重要生物資源。1981年Rinehart等首次從海鞘Trididemnumsolidum中分出并測(cè)定了環(huán)肽DidemninsA,B和C的結(jié)構(gòu),證實(shí)了它們具有抗腫瘤、抗病毒的活性,其中DidemninB的活性最強(qiáng),既能抑制蛋白質(zhì)的合成,也能抑制DNA、RNA的合成,對(duì)黑色素瘤Bl6細(xì)胞周期作用的研究表明,它可殺傷各種周期細(xì)胞,尤其是對(duì)G1至S期細(xì)胞敏感。人們又以合成、半合成或從其他海鞘中分離等多種方式得到了許多Didemnin的同系物。對(duì)多達(dá)42種Didemnin類化合物進(jìn)行的結(jié)構(gòu)與功能的對(duì)比研究表明,天然環(huán)肽核為其生物活性所必需,而對(duì)側(cè)鏈的化學(xué)修飾則會(huì)明顯地影響其活性強(qiáng)弱,如第二代Didemnin——脫氫DidemninB的體內(nèi)外抗腫瘤活性比Didemnin強(qiáng)許多,目前脫氫DidemninB已進(jìn)入臨床研究。1.1.3重新確定ndk-nfpv1和nf-18e的活性物質(zhì)海兔(Dolabellaauricularia)屬軟體動(dòng)物門腹足綱后腮亞綱海兔科動(dòng)物,從中追蹤分離到18個(gè)抗癌活性肽Dolastatin1~18,其中研究的比較多的是Dolastatin3,10,15,在抗癌新藥開發(fā)方面具有巨大潛力。Suenaga等從日本海兔中分離得到了1種活性物質(zhì)aurilide,經(jīng)核磁共振和高效液相色譜(HPLC)技術(shù)測(cè)定結(jié)構(gòu),表明其為26個(gè)氨基酸殘基組成的環(huán)肽。合成的類似物對(duì)人宮頸癌細(xì)胞HelaS3有抗腫瘤活性,IC50為0.011mg/mL,更多的生物學(xué)活性正在研究中。1.2抗菌肽agapRA系列肽(RAs)和Bouvardin是從RubiacordifoliaL和Bouvardia植物中發(fā)現(xiàn)的環(huán)狀六肽,包括獨(dú)特的酪氨酸環(huán)狀單位,其中RA-Ⅶ(2)在日本作為潛在的抗腫瘤藥物進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)。還有一些環(huán)肽,如cyclo(-Arg-Gly-Asp-d-Phe-Lys-)和cyclo(-Arg-Gly-Asp-d-Phe-Val-),也有一定的抗腫瘤應(yīng)用價(jià)值。Alloferon(Alloferon1:HGVSGHGQHGVHG,13aa;Alloferon2:GVSGHGQHGVHG,12aa)是從1種蒼蠅Calliphoravicina中提取到的一系列具有抗腫瘤和抗菌作用的小肽,可以提高小鼠的脾和血內(nèi)自然殺傷淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒作用,自然殺傷淋巴細(xì)胞具有天然抗病毒抗腫瘤免疫作用,在體內(nèi)試驗(yàn)中能誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生。柞蠶中含有的抗菌肽(殺菌肽)也是一類作用很強(qiáng)的抗癌成分,是由33~39個(gè)氨基酸組成的一類堿性多肽,Mr為4000~5000,已分離并測(cè)定其氨基酸序列一級(jí)結(jié)構(gòu)的多達(dá)數(shù)十種,它們對(duì)細(xì)菌、病毒及腫瘤細(xì)胞均有選擇性殺傷作用。凌斌勛等建立荷人鼻咽癌細(xì)胞株CNE2的裸鼠模型,通過腹腔注射和局部注射柞蠶抗菌肽2種途徑進(jìn)行治療干預(yù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果治療組與對(duì)照組比較腫瘤明顯縮小,有顯著差異(P<0.01),抗菌肽局部處理組癌瘤大面積出血壞死,較多的炎細(xì)胞浸潤(rùn),裸鼠心臟、肝臟、腎臟未見明顯病變,外周血白細(xì)胞無明顯下降,證明柞蠶抗菌肽具有較明顯的抗裸鼠移植性人鼻咽癌CNE2的作用,并且無明顯毒副作用。眼鏡蛇毒的重要活性成分之一細(xì)胞毒素(cytotoxin,CTX)是由60~63個(gè)氨基酸殘基組成的多肽,Mr6000~7000,是眼鏡蛇毒中Mr較小的活性多肽。許云祿等應(yīng)用凝膠過濾、離子交換柱色譜及疏水柱色譜等方法從舟山眼鏡蛇毒中分離純化得到了不含磷酯酶A2(PLA2)的CTX-F,經(jīng)過體外實(shí)驗(yàn),證明CTX-F能抑制人肝癌細(xì)胞Bel7404、人肺腺癌A549細(xì)胞和小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞的增殖。在中國(guó)東亞鉗蝎的毒液中分離純化得到抗瘤止痛肽ANTP,Mr為6280,其N端25個(gè)氨基酸序列為:VRDGYIADDKNKAYFLGRNAYCDDG。通過PCR的方法獲得了中國(guó)東亞鉗蝎毒液的抗瘤止痛肽(AGAP)的基因,并在大腸桿菌中獲得表達(dá)。大部分重組的AGAP以包涵體的形式表達(dá)。重組后的AGAP在小鼠體內(nèi)試驗(yàn)具有抗腫瘤和止痛活性。2抗菌肽和氨基酸類似物合成肽庫(kù)利用化學(xué)合成技術(shù)直接以氨基酸為原料合成多肽,可以發(fā)現(xiàn)或找到天然不存在但具有生物活性的多肽,或得到模擬自然界復(fù)雜生物大分子表位的活性多肽,通過化學(xué)修飾的方法,還能在保持多肽活性的基礎(chǔ)上提高其穩(wěn)定性和可溶性,在抗腫瘤領(lǐng)域也有很大的應(yīng)用價(jià)值?？鼓[瘤尿蛋白(antineoplasticurinaryprotein,ANUP)是人尿中1種Mr為32000的蛋白質(zhì),具有抗腫瘤和抗血管生成的作用。Kathleen等人工合成了與ANUP的N端同源的2個(gè)多肽,A序列為:ELKCYTCKEPMTSASCRTIT,B序列為:pyroELKCYTCKEPMTSASCRTIT,裸鼠實(shí)驗(yàn)表明,它們對(duì)人宮頸癌細(xì)胞Hela的抑制率達(dá)到70%,雞胚胎尿絨毛膜試驗(yàn)(chickchorioallantoicmembraneassay,CAM)結(jié)果表明,這2個(gè)多肽都具有抑制血管生成的作用。麻亞鋒等從1995年起就從人尿中分離純化抗腫瘤多肽,從健康男性尿液中得到了抗瘤多肽UAP,由Glu、Leu、Pro、Tyr、Ala等氨基酸組成,其Mr小于1000,對(duì)體外培養(yǎng)的SMMC7721、MKN45和U937細(xì)胞具有抑制作用,但對(duì)人正常白細(xì)胞HNI無明顯抑制作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明UAP對(duì)小鼠HAC肝癌、小鼠LEWIS肺癌和小鼠S180肉瘤瘤體生長(zhǎng)有明顯抑制作用。張冬梅等在以上工作基礎(chǔ)上合成了一系列多肽及其類似物,分別研究了它們的抗腫瘤活性,從中篩選到1個(gè)具有很強(qiáng)抑瘤作用的八肽,定名為ND100,Mr為846.9。體內(nèi)抑瘤試驗(yàn)結(jié)果表明,ND100對(duì)小鼠H22肝癌、小鼠Lewis肺癌和小鼠S180肉瘤的生長(zhǎng)均有明顯抑制作用,有效劑量為2.5mg/kg,當(dāng)使用高劑量(15mg/kg)時(shí),對(duì)3種小鼠移植性腫瘤的抑制率達(dá)70%以上,且具有量效關(guān)系。同時(shí)ND100對(duì)小鼠紅細(xì)胞和白細(xì)胞的數(shù)量均無影響。合成肽Arg-Gly-Asp(RGD)和Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg(YIGSR)和已被證實(shí)可競(jìng)爭(zhēng)性地占據(jù)腫瘤細(xì)胞膜相關(guān)受體,明顯降低腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。劉麗艷等設(shè)計(jì)合成了用賴氨酸的2個(gè)氨基把RGD和YIGSR連接起來的雜合肽α-精甘天冬氨酰-ε-酪異亮甘絲精氨酰甲酯,該化合物降低了LA795細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移小鼠的肺重量和肺轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù),對(duì)LA795小鼠肺腺癌細(xì)胞自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移表現(xiàn)了明顯的阻滯作用,具有較強(qiáng)的抗腫瘤侵襲活性,有進(jìn)一步的應(yīng)用和開發(fā)研究的前景。含有氧肟酸的環(huán)肽CHAP1是1種組蛋白去乙?；种苿?可以抑制組蛋白去乙?；?HDAC)的活性。Komatsu等合成了一系列CHAP的衍生物,經(jīng)過構(gòu)象—活性研究,篩選出了活性和穩(wěn)定性最強(qiáng)的1個(gè)化合物CHAP31。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,CHAP31對(duì)小鼠黑色素瘤B16/BL6有抗腫瘤活性,同時(shí),對(duì)裸鼠乳房癌BSY-1、肺癌DMS114、黑色素瘤LOX-IMVI、胃癌MKN-7生長(zhǎng)也有一定的抑制作用,有希望成為新一代的抗腫瘤藥物。3噬菌體表面肽類模擬物的篩選1990年,由Parmley和Smith提出并建立的噬菌體展示技術(shù)(phagedisplaytechnique,PDT)是以噬菌體或噬菌粒為載體,其基本原理是在M13噬菌體的外殼蛋白PⅢ或PⅧ的基因中隨機(jī)地插入任意大小的多聚核苷酸片段,每個(gè)序列不同的噬菌體就是1個(gè)克隆,結(jié)合親和技術(shù),可以得到能和特定配體專一結(jié)合的一些克隆,經(jīng)過多次反復(fù)的篩選,可以得到特異結(jié)合的克隆,最后經(jīng)DNA測(cè)序,可以推斷和配體專一結(jié)合肽段的序列。目前噬菌體展示技術(shù)經(jīng)常用于蛋白質(zhì)抗原表位及其類似物的鑒定和篩選,此外,噬菌體展示技術(shù)還可以得到各種類型分子的肽類模擬物,在篩選抗腫瘤小肽方面也有很廣泛的用途。張克志等通過噬菌體展示技術(shù)在荷瘤裸鼠(原位移植模型)體內(nèi)篩選獲得可特異性結(jié)合多種人肝細(xì)胞肝癌細(xì)胞系和肝癌腫瘤血管7肽小分子LCI-X7,采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法、流式細(xì)胞儀、Brdu染色、Boyden小室等方法分別研究其對(duì)細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞周期、運(yùn)動(dòng)及侵襲的影響。與具有相同氨基酸不同序列的對(duì)照肽相比,LCI-X7在1×10-9mol/L可減少約70%HCCLM6細(xì)胞的穿膜運(yùn)動(dòng)及侵襲;在裸鼠實(shí)驗(yàn)中,LCI-X7(500μg/kg)與對(duì)照相比,顯著降低肝內(nèi)及肺轉(zhuǎn)移率;腫瘤微血管染色的結(jié)果顯示,LCI-X7治療可降低微血管密度至51.3%。LCI-X7確切作用機(jī)制還在研究中。Laakkonen等通過噬菌體表面肽庫(kù)技術(shù)篩選得到1個(gè)九肽LyP-1。熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明,小鼠靜脈注射此肽后,在MDA-MB-435乳腺癌腫及其轉(zhuǎn)移物中明顯堆積,使得病灶清晰可見。LyP-1的堆積與腫瘤的缺氧部位相吻合。體外實(shí)驗(yàn)中,人類乳癌細(xì)胞結(jié)合并內(nèi)質(zhì)化LyP-1后,發(fā)生死亡。黑色素瘤細(xì)胞無法結(jié)合LyP-1,因此不受到LyP-1的作用。LyP-1作用于移植乳癌的小鼠,抑制了腫瘤的生長(zhǎng),腫瘤中含有凋亡細(xì)胞。因此,LyP-1其抗腫瘤作用依賴于凋亡或細(xì)胞毒作用。4生物活性肽的應(yīng)用肽類藥物的資源數(shù)量巨大,利用提取、化學(xué)合成、噬菌體展示技術(shù)和蛋白酶降解可得到各種不同的肽,目前從不同大小的隨機(jī)肽庫(kù)中篩選有活性小肽的核心問題,是如何從中檢測(cè)到有活性的組分,而后能分離出活性組分,并鑒定其結(jié)構(gòu)。腫瘤的發(fā)生是多種因素作用的結(jié)果,但最