大豆發(fā)酵發(fā)酵及其中毛霉氨肽酶的分離純化

大豆發(fā)酵發(fā)酵及其中毛霉氨肽酶的分離純化

毛霉菌是腐敗發(fā)酵的主要細(xì)菌之一。在腐殖生產(chǎn)中，它主要是通過(guò)消化和分析酶來(lái)分解豆腐胚胎中的大豆蛋白。腐乳成品中的蛋白質(zhì)主要是以多肽形式存在,具有相當(dāng)高的水解程度,已經(jīng)從中分離出多種具有生理活性的多肽。對(duì)眾多腐乳產(chǎn)品的感官分析表明,腐乳產(chǎn)品通常不具有一般蛋白水解物所特有的苦味。因此毛霉蛋白酶在解決植物蛋白(尤其是大豆蛋白)水解率低、水解產(chǎn)物具有強(qiáng)烈的苦味等難題方面具有很大的潛力。目前行業(yè)內(nèi)僅有少數(shù)學(xué)者對(duì)毛霉的發(fā)酵產(chǎn)酶特性以及粗酶的催化、水解特性進(jìn)行過(guò)探討。然而,毛霉由于長(zhǎng)期受到高蛋白環(huán)境條件的馴化,它通常具有合成及分泌多種胞外蛋白酶的能力,其胞外的蛋白酶系是由多種蛋白酶所構(gòu)成的復(fù)雜體系,因此,單純從總體上(即粗酶的研究)并不能完全了解其內(nèi)在的特性。為全面了解這一蛋白酶系的組分構(gòu)成、各組分的催化特性以及相互之間的作用,課題組開(kāi)展了相關(guān)的研究。在前期的工作中,對(duì)毛霉胞外的內(nèi)肽酶組分進(jìn)行了分離純化及性質(zhì)分析,并考察了它們對(duì)大豆蛋白的水解特性。結(jié)果表明,毛霉胞外主要有3個(gè)內(nèi)肽酶組分,包括一個(gè)堿性蛋白酶和兩個(gè)酸性蛋白酶,堿性蛋白酶與酸性蛋白酶之間有一定的肽鍵選擇互補(bǔ)性,兩者共同作用于大豆蛋白可以實(shí)現(xiàn)大豆蛋白的深度水解。然而,感官分析卻發(fā)現(xiàn),大豆蛋白的毛霉內(nèi)肽酶水解物也有強(qiáng)烈的苦味。由此看來(lái),在毛霉胞外可能存在一些具有脫苦效果的蛋白酶組分,為此,我們對(duì)毛霉胞外的氨肽酶組分進(jìn)行了分離純化并對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行了研究。1材料和方法1.1其他蛋白及氨基酸雅致放射毛霉ActinomucorelegansAS3.2778(發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室保藏菌種);DEAE-Sepharosee、Phenyl-Sepharose、SephadexG50購(gòu)自Pharmacia公司;苯甲基磺酰氟(PMSF)、EDTA、E-64、Pepstatin,購(gòu)自Amersco公司;Gly-Pro-pNA、Gly-pNA、Pro-pNA、Arg-pNA、Leu-pNA、Val-pNA等,購(gòu)自Sigma公司;大豆分離蛋白(SPI,蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為87.35%),購(gòu)自哈爾濱高科大豆食品有限公司;Alcalase蛋白酶,購(gòu)自Novo公司;其他試劑均為分析純或生化試劑。1.2測(cè)試方法1.2.1酶活單位的測(cè)定采用Folin-酚法。1.5mL離心管中加入0.3mL適當(dāng)稀釋的酶液及0.3mL1.5%酪蛋白(溶于0.05mol/LpH5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液),40℃反應(yīng)l0min,再加0.6mL0.4mo1/L的三氯乙酸終止反應(yīng),靜置15min后14000×g離心10min,取上清液0.6mL,加入3mL0.4mol/LNaCO3溶液及0.6mL福林酚試劑,于40℃顯色20min,于680nm測(cè)其吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活單位。1.2.2酶解履行的測(cè)定150μL酶液加入150μL0.2mmol/LL-脯氨酸-對(duì)硝基苯胺,混勻后置于35℃水浴反應(yīng)20min,沸水浴滅活3min。然后用微量比色皿測(cè)定405nm吸光度。以150μL滅活的酶液加150μL0.2mmol/LL-脯氨酸-對(duì)硝基苯胺作為空白對(duì)照。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活。酶活定義:實(shí)驗(yàn)條件下,每分鐘水解L-脯氨酸-對(duì)硝基苯胺(Pro-pNA)產(chǎn)生1μg對(duì)硝基苯胺所需酶量即為1個(gè)酶活單位。1.2.3粗酶液的提取稱(chēng)取一定量干麩曲(發(fā)酵方法見(jiàn)文獻(xiàn))加入10倍體積的0.3mol/LNaCl溶液,混勻后于30℃水浴中抽提1.5h,紗布過(guò)濾后在4℃,7000×g離心10min,取上清液即得到粗酶液。1.2.4毛霉氨酸酶的純度1.2.4.u3000乳化取一定體積的粗酶液,在冰水浴上緩慢加入固體(NH4)2SO4到飽和度為50%,充分溶解后在4℃冰箱中靜置4h,于4℃,12000×g離心20min,取上清液繼續(xù)加入固體(NH4)2SO4至飽和度為70%,4℃冰箱中靜置12h,然后于4℃,12000×g離心20min,蛋白沉淀用0.02mol/L,pH值7.5的Tris-HCl緩沖液溶解,并透析脫鹽。1.2.4.鹽析脫鹽緩沖液的提取用0.02mol/L,pH7.5的Tris-HCl緩沖液平衡DEAE-Sepharose陰離子交換柱(3.0cm×30cm),取一定量鹽析脫鹽后的酶液,加樣陰離子交換柱。用平衡緩沖液充分洗柱后,用A液:0.02mol/L,pH7.5的Tris-HCl緩沖液;B液:0.5mol/LNaCl溶液(溶于0.02mol/L,pH7.5的Tris-HCl緩沖液)進(jìn)行階梯等度洗脫,流速1.5mL/min,收集50%B階梯洗脫蛋白峰,然后用超濾離心管濃縮收集液。1.2.4.phenyl-酶染色及等度洗脫用1.2mol/L(NH4)2SO4溶液(溶于0.05mol/L,pH7.5的PBS緩沖液)平衡Phenyl-Sepharose疏水層析柱(1.6cm×20cm)。將上一步收集的濃縮酶液與2.4mol/L(NH4)2SO4溶液(溶于0.1mol/L,pH7.5的PBS緩沖液)等體積混和后加樣Phenyl-Sepharose疏水層析柱,用平衡緩沖液充分沖洗疏水柱,然后用A液:0.05mol/L,pH7.5的PBS緩沖液;B液:1.2mol/L(NH4)2SO4溶液(溶于0.05mol/L,pH7.5的PBS緩沖液)進(jìn)行階梯等度洗脫,流速1.0mL/min。收集60%B階梯洗脫蛋白峰(即脯氨酸氨肽酶蛋白峰)。1.2.4.濃縮酶液的制備用0.02mol/L,pH7.5PBS緩沖液平衡SephadexG50凝膠柱(1.6cm×100cm),分別加樣1.2.4.2和1.2.4.3的濃縮酶液,用0.02mol/L,pH7.5的PBS緩沖液洗脫,流速0.5mL/min。收集活性蛋白峰,用超濾離心管濃縮收集的樣品。1.2.5毛霉氨酸酶的催化劑性質(zhì)1.2.5.毛霉氨肽酶活性測(cè)定按照氨肽酶活性測(cè)定方法,分別以Gly-Pro-pNA、Gly-pNA、Pro-pNA、Arg-pNA、Leu-pNA、Val-pNA等為底物,測(cè)定毛霉氨肽酶對(duì)不同底物的水解活性。1.2.5.溫度對(duì)毛霉氨肽酶活性的影響按照酶活測(cè)定方法分別于不同的溫度(30～70℃)下測(cè)定毛霉氨肽酶的活性,考察溫度對(duì)毛霉氨肽酶活性的影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制溫度-活力曲線,并由此確定毛霉氨肽酶的最適作用溫度。1.2.5.ph對(duì)毛霉氨肽酶活性的影響按照酶活測(cè)定方法分別于不同pH緩沖條件下(pH3.0～5.0,0.05mol/L乙酸緩沖鹽;pH6.0～7.0,0.05mol/L磷酸緩沖鹽;pH8.0～9.0,0.02mol/LTris-HCl;pH9.5～10.5,0.02mol/Lglycine-NaOH)測(cè)定毛霉氨肽酶的活性,考察pH對(duì)毛霉氨肽酶活性的影響。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制pH-活力曲線,并由此確定毛霉氨肽酶的最適作用pH范圍。1.2.5.溫度對(duì)氨肽酶穩(wěn)定性的影響在氨肽酶的穩(wěn)定pH條件下,將酶液分別于不同溫度(30～70℃)下保溫30min,測(cè)定保溫前后氨肽酶活性的變化,考察溫度對(duì)氨肽酶穩(wěn)定性的影響。以酶活殘留率對(duì)溫度作圖,繪制氨肽酶熱失活曲線。1.2.5.酶活殘留率測(cè)定用不同的緩沖液分別調(diào)節(jié)酶液的pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0,于25℃放置約1h,測(cè)定放置前后酶活,計(jì)算酶活殘留率。以酶活殘留率對(duì)pH值作圖,繪制氨肽酶的pH穩(wěn)定曲線。1.2.5.抑制劑混和對(duì)氨肽酶活性的影響在酶的穩(wěn)定pH值條件下,將酶液與不同類(lèi)型的抑制劑混和,25℃下放置約30min,測(cè)定加入抑制劑保溫后氨肽酶的活性?？疾煲种苿?duì)氨肽酶活性的影響。1.2.5.7金屬離子對(duì)酶活性的影響在酶的穩(wěn)定pH值條件下,將酶液與不同的金屬離子溶液混和,于室溫中放置30min后測(cè)定酶活,比較各種金屬離子對(duì)氨肽酶活性的影響。1.2.6alcarlo酶解法用蒸餾水配制5g/100mL大豆分離蛋白,用1mol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至pH值11.0,置于90℃恒溫水浴中預(yù)處理15min,冷卻后按酶活與底物比為3000u/g加入Alcalase堿性蛋白酶,置于50℃的水浴中保溫酶解5h。水解結(jié)束后直接加熱煮沸,并趁熱過(guò)濾,濾液冷凍干燥,即得到大豆多肽樣品。1.2.7硫酸奎寧溶液110以硫酸奎寧為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物,采用感官分析的方法對(duì)大豆多肽的苦味進(jìn)行了評(píng)價(jià),大豆多肽苦味強(qiáng)度以具有相同苦味的硫酸奎寧摩爾濃度表示。配制一定摩爾濃度的硫酸奎寧溶液,分別稀釋到10-4、10-5、10-6、10-7、10-8mol/L,對(duì)應(yīng)的苦味強(qiáng)度分別為:強(qiáng)、較強(qiáng)、中、弱、無(wú)。感官評(píng)定小組由8人組成,評(píng)定人員用蒸餾水漱口后,取待測(cè)水解液3～5mL置于口中,10s后吐出,漱口后取與之苦味程度相近的標(biāo)準(zhǔn)液品嘗,如確認(rèn)兩苦味相近,即可把待測(cè)水解液定義為該標(biāo)準(zhǔn)液的苦味值,否則取其他標(biāo)準(zhǔn)液品嘗,直至確定其苦味值。1.2.8大豆多肽的風(fēng)險(xiǎn)氧化用pH6.5,0.02mol/L磷酸鹽緩沖液配制3%大豆多肽溶液,按氨肽酶酶活與底物比為3000u/g加入純化后的氨肽酶,置于35℃水浴保溫3h,每隔一定時(shí)間取樣進(jìn)行苦味感官分析。2結(jié)果與分析2.1分離和純化氨肽酶的活性采用層析的方法對(duì)毛霉胞外的氨肽酶進(jìn)行了初步的分組分離及純化。首先,采用DEAE-Sepharose陰離子交換層析對(duì)鹽析后樣品進(jìn)行了初步的分離純化,通過(guò)對(duì)其洗脫方法進(jìn)行優(yōu)化,最終使氨肽酶組分完全集中在50%B的洗脫峰(如圖1示),并實(shí)現(xiàn)了內(nèi)肽酶與氨肽酶的分離,同時(shí)使氨肽酶得到了濃縮;然后,采用疏水層析的方法對(duì)上一步收集的氨肽酶樣品做進(jìn)一步的分離(如圖2),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在疏水層析中可以分離得到2個(gè)有活性的洗脫峰,即60%B洗脫峰(活性峰1)和20%B洗脫峰(活性峰2),據(jù)此可以初步確定,毛霉胞外至少有2個(gè)不同的氨肽酶組分;相比而言,峰1的氨肽酶活性要強(qiáng)得多,峰2僅為其活性的30%左右;最后,采用凝膠層析的方法對(duì)疏水層析收集的活性峰1進(jìn)行了進(jìn)一步的純化(如圖3),并同時(shí)對(duì)樣品進(jìn)行脫鹽處理。通過(guò)以上一系列的純化操作,雖然可以實(shí)現(xiàn)內(nèi)肽酶與氨肽酶的分離,2個(gè)氨肽酶組分之間也得以分開(kāi),氨肽酶的純度有所提高,但是最終并不能完全純化出目標(biāo)蛋白。純化得到的氨肽酶樣品中仍然含有一定量的雜蛋白。因此,對(duì)毛霉氨肽酶的純化還需考慮其他的方法。2.2毛霉氨肽酶活性毛霉氨肽酶對(duì)不同底物的水解活性如表1所示。毛霉氨肽酶對(duì)不同底物的水解活性顯示出一定的差異?？偟膩?lái)看,毛霉氨肽酶主要對(duì)小肽N端疏水性氨基酸,如Pro、Leu、Ile、Phe構(gòu)成的肽鍵有很強(qiáng)的水解活性;而對(duì)小肽N端非疏水性氨基酸,如Arg、Ala、Gly構(gòu)成的肽鍵水解活性非常弱,甚至無(wú)水解活性。比較毛霉氨肽酶對(duì)表中底物的水解活性來(lái)看,該氨肽酶對(duì)Pro-pNA有最大的水解活性,是一脯氨酸氨肽酶。2.3白酶抑制劑抑制酶活性抑制劑及金屬離子對(duì)毛霉氨肽酶活性的影響見(jiàn)表2。結(jié)果表明,在所試驗(yàn)的幾種蛋白酶抑制劑中,僅1mmol/L的PMSF對(duì)氨肽酶有部分抑制作用,但不能完全抑制其活性。由此說(shuō)明,毛霉氨肽酶可能是一種絲氨酸蛋白酶,但其催化特性及結(jié)構(gòu)不同于一般的絲氨酸蛋白酶;常見(jiàn)金屬離子對(duì)毛霉氨肽酶活性的影響不明顯。2.4ph值對(duì)活性的影響pH值對(duì)毛霉氨肽酶活性及穩(wěn)定性的影響如圖4所示。與毛霉內(nèi)肽酶相比,毛霉氨肽酶的pH-活性曲線相對(duì)較窄,pH值對(duì)其活性的影響非常顯著。毛霉氨肽酶在pH值6.5左右有最大催化活性,而在pH值5.0時(shí),氨肽酶的活性?xún)H為最大活性的50%左右。此外,毛霉氨肽酶在中性附近(pH值5.0～8.0)有相對(duì)較好的穩(wěn)定性,當(dāng)pH值低于5.0時(shí)該氨肽酶會(huì)迅速的變性失活。2.5溫度對(duì)其催化活性的影響溫度對(duì)毛霉氨肽酶活性及穩(wěn)定性的影響如圖5所示。在相對(duì)較低的溫度(25～45℃)下,毛霉氨肽酶活性隨溫度的升高變化的幅度較平緩;當(dāng)溫度超過(guò)45℃后,酶活會(huì)迅速下降;該氨肽酶在40～45℃的范圍內(nèi)有最大催化活性,然而其在25℃下也顯示出相對(duì)較高的活性,約為最大活性的50%,這可能與該酶相對(duì)較低的熱穩(wěn)定性有一定的關(guān)系。由于在相對(duì)較低的溫度(25～45℃)下,酶已經(jīng)有一定程度的失活,因此表現(xiàn)出溫度升高對(duì)促進(jìn)反應(yīng)速度的加速效應(yīng)不顯著。圖5B的結(jié)果確實(shí)顯示,毛霉氨肽酶的熱穩(wěn)定性相對(duì)較差,其在30℃以?xún)?nèi)有較好的穩(wěn)定性,當(dāng)溫度超過(guò)40℃酶會(huì)迅速失活。例如,在40℃保溫30min后,酶活大約有10%的損失;在50℃保溫30min后,酶活完全喪失。2.6脫苦處理大豆多肽的處理對(duì)其活性氨基酸的影響純化的毛霉氨肽酶對(duì)大豆多肽的脫苦效果如圖6所示。毛霉氨肽酶對(duì)大豆多肽有顯著的脫苦效果,隨著脫苦反應(yīng)的進(jìn)行,大豆多肽的苦味逐漸減弱并最終消除。在氨肽酶脫苦的初期,大豆多肽的苦味變化極為顯著;初始3%的大豆多肽溶液有很強(qiáng)烈的苦味,用氨肽酶脫苦處理0.5h后,其苦味明顯減弱為中等強(qiáng)度;脫苦處理1h后,其苦味已非常弱(略有微弱的苦味);脫苦處理3h后,