乳清蛋白的生物活性及其應(yīng)用

乳清蛋白的生物活性及其應(yīng)用

乳清蛋白富含必要氨基酸，是一種高含量的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)。它含有許多活性物質(zhì)，如含有蛋白質(zhì)-谷氨酸、蛋白質(zhì)-谷氨酸（氨基）、牛血清蛋白（bsa）、免疫球蛋白、乳鐵蛋白（lf）、糖苷（gsmp）、乳酶等。隨著乳源活性肽研究與產(chǎn)品開發(fā)的興起,發(fā)現(xiàn)乳清蛋白中含有具有免疫調(diào)節(jié)、降血壓、降血糖、降膽固醇、抗氧化、抗菌和抗病毒等生物活性的潛在肽段,這對(duì)進(jìn)一步提升乳清蛋白產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)功能,提高乳清蛋白產(chǎn)品的附加值及開發(fā)利用具有重大意義。本文就近年來有關(guān)乳清蛋白及其活性多肽的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。1乳清蛋白主要成分乳清蛋白是牛乳中的一類集營(yíng)養(yǎng)性、功能性于一身的重要蛋白質(zhì),其主要生物活性成分包括β-乳球蛋白(β-LG)、α-乳白蛋白(α-LA)、血清白蛋白(BSA)、免疫球蛋白和酪蛋白糖巨肽(CGMP)等,其中α-乳白蛋白約占20%,β-乳球蛋白約占50%。此外,乳鐵蛋白(LF)、乳過氧物酶、β-微球蛋白、溶菌酶、多種生長(zhǎng)因子及λ-球蛋白等微量成分也是乳清蛋白不可或缺的組成部分,在乳清蛋白生理功能方面發(fā)揮著重要作用。乳清蛋白中各組分及主要生理功能見表1。2青酮及其化合物的生物學(xué)活性2.1乳清蛋白的保護(hù)作用由于耐抗生素致病菌的出現(xiàn),具有抗菌特性的蛋白質(zhì)成為研究熱點(diǎn)。乳清中含有具有廣譜抑菌特性的成分,能夠殺傷細(xì)菌、真菌、病原蟲,抑制病毒繁殖和特異性抑制某些腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。2004年,Leonie等通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明乳鐵蛋白是一種抗菌抗毒劑,乳鐵蛋白上的正電荷對(duì)抵抗巨細(xì)胞感染具有重要作用,通過抑制病毒侵入細(xì)胞來抵抗巨細(xì)胞病毒的感染。隨后,Weng等通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明,牛乳鐵蛋白(LF)能抑制病毒和宿主細(xì)胞發(fā)生作用,保護(hù)ICR小鼠免受腸病毒71型侵害。近幾年來,研究發(fā)現(xiàn)乳清蛋白、β-乳球蛋白、乳鐵蛋白進(jìn)行化學(xué)改性可以增強(qiáng)其生物活性。2007年P(guān)an等將乳鐵蛋白酰胺化以改變其蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)而增加其凈正電荷數(shù),結(jié)果表明酰胺化的乳鐵蛋白對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抗菌能力增強(qiáng)。酰胺化β-乳球蛋白對(duì)熒光假單胞菌、莓實(shí)假單胞菌、枯草芽孢桿菌具有很強(qiáng)的殺菌作用。同年,Miralles等研究發(fā)現(xiàn)β-乳球蛋白與殼聚糖發(fā)生美拉德反應(yīng)后,糖基化β-乳球蛋白對(duì)大腸桿菌具有殺菌作用。隨后,Sitohy等發(fā)現(xiàn)酯化后的乳清蛋白對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒Ⅰ型和柯薩奇病毒B6型的抗性作用,通過抑制病毒蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)譯以及與病毒衣殼蛋白發(fā)生疏水性作用來減緩這兩種病毒增殖。乳清蛋白與癌癥防治的關(guān)系也被廣泛的研究。2009年,Castro等研究了不同濃度的乳清分離蛋白對(duì)B16F10黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響,發(fā)現(xiàn)低濃度的乳清分離蛋白(0.98～100mg/mL)更有利于抑制癌細(xì)胞增殖。2.2分離蛋白的免疫調(diào)節(jié)作用乳清蛋白中含有調(diào)節(jié)免疫功能的成分,并且乳清蛋白降解產(chǎn)生的多肽在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著重要的作用。乳清蛋白能夠增強(qiáng)免疫細(xì)胞功能,加速抗體生成,增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力以及刺激機(jī)體淋巴細(xì)胞的增殖。近幾年的研究結(jié)果表明,乳清蛋白中的免疫調(diào)節(jié)成分還能夠抑制腫瘤生長(zhǎng)。Kay等通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明IMUCAREWPC可增強(qiáng)有絲分裂原(ConA)刺激小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng)。同時(shí),Mercier等證明在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加濃度為100μg/mL的MF-WPI(微過濾法獲得的乳清分離蛋白)可以促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖。隨后,Gauthier等于2008年通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和酶聯(lián)免疫法研究乳清蛋白及其胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶復(fù)合酶解產(chǎn)物的免疫調(diào)節(jié)特性,結(jié)果表明乳清分離蛋白能夠刺激小鼠脾臟細(xì)胞的增殖,并且酶解產(chǎn)物能明顯增加γ-干擾素的分泌。2.3抗氧化活性的檢測(cè)方法研究發(fā)現(xiàn),人類的衰老和許多疾病如心肌梗死、動(dòng)脈硬化、癌癥、骨質(zhì)疏松癥和肥胖等都與人體產(chǎn)生的自由基有關(guān)。通過攝入具有抗氧化活性的物質(zhì)可有效降低體內(nèi)的自由基含量,防止氧化反應(yīng)的發(fā)生,提高機(jī)體對(duì)疾病的抵抗能力。各類天然抗氧化劑以其低毒、高效等特點(diǎn)正越來越受到人們重視。目前,已有利用乳清蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白制備抗氧化肽的報(bào)道,也有研究表明乳清蛋白水解物在鐵催化卵磷脂脂質(zhì)氧化體系、銅催化脂質(zhì)氧化體系中具有抗氧化作用,另外,乳清蛋白水解物還可以減少熟肉制品冷藏過程中的脂類氧化。在多肽抗氧化活性評(píng)價(jià)體系中,基于不同自由基清除原理,常用的抗氧化活性檢測(cè)方法主要有:DPPH自由基清除能力、羥基自由基清除能力、超氧陰離子自由基、氮氧自由基清除能力和ABTS自由基清除能力等。其他常見的檢測(cè)方法還有脂質(zhì)體系的抗氧化抑制能力和還原能力法等,一些高靈敏度的新型檢測(cè)技術(shù)也被逐漸引入到抗氧化活性的檢測(cè)方法中。2009年,Kong等利用電子自旋共振儀測(cè)定了純化后的不同分子量范圍乳清蛋白肽對(duì)DPPH、羥基和超氧陰離子自由基的清除能力,發(fā)現(xiàn)分子量在100～2800Da的乳清蛋白多肽清除自由基能力最強(qiáng),對(duì)DPPH、羥基和超氧陰離子自由基的清除率分別為58.67%、65.67%和69.87%。Hern?ndez等比較了胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶和CorlosePP水解β-乳球蛋白和α-乳白蛋白后的抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)CorlosePP的酶解產(chǎn)物具有較強(qiáng)的自由基清除活性,分子量小于3kDa的組分是主要的抗氧化活性組分,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)乳清蛋白組分延遲脂類氧化的能力與組氨酸和疏水性氨基酸的存在有關(guān),其中Trp-Tyr-Ser-Leu-Ala-Met-Ala-Ser-Asp-Ile具有比BHA更高的抗氧化活性。彭新顏等采用堿性蛋白酶酶解乳清蛋白,通過測(cè)定水解物對(duì)卵磷脂脂質(zhì)氧化體系的硫代巴比妥酸值(TBARS)抑制作用、過氧化值(PV)的抑制作用、亞鐵還原能力、金屬離子螯合能力、DPPH自由基清除能力,發(fā)現(xiàn)底物濃度為5%、蛋白酶的添加量為2%、水解時(shí)間為5h條件下獲得的乳清蛋白水解物具有最強(qiáng)的抗氧化能力。進(jìn)一步研究表明酶解物的抗氧化活性與某些特征氨基酸序列存在著一定相關(guān)性,但還未有研究闡明具體構(gòu)效關(guān)系。目前,對(duì)于乳清蛋白肽的抗氧化活性多通過體外方法檢測(cè),對(duì)于其抗氧化機(jī)制方面有必要通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞和機(jī)體內(nèi)兩個(gè)水平上進(jìn)一步深入研究。2.4乳清蛋白源的降血壓肽高血壓是心血管疾病的主要危險(xiǎn)因素。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensinconvertenzyme,ACE)是一種含Zn2+輔基的二肽羧肽酶,能夠催化血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)變?yōu)檠芫o張素Ⅱ,其存在于體內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng)(reninangiotensionsystemun,RAS)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(kallikrein-kininsystem,KKS)中,對(duì)血壓的調(diào)節(jié)起著重要作用。ACE抑制肽是具有ACE抑制活性的多肽物質(zhì),一般由2～14個(gè)氨基酸組成,其抑制活性與其特殊的肽鏈結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。近年來,國(guó)內(nèi)外對(duì)乳清蛋白源降血壓肽的制備工藝、分離純化、降壓效果綜合評(píng)價(jià)等方面進(jìn)行了廣泛研究。2007年,Ferreira等用胰蛋白酶酶解乳清蛋白制備ACE抑制肽,并用RP-HPLC分離得到肽段ALPMHIR,該肽段是目前檢測(cè)出的最有效的β-乳球蛋白衍生物ACE抑制肽。同年,Costa等研究了不同熱處理溫度和不同蛋白酶處理對(duì)乳清蛋白水解物降血壓活性的影響,結(jié)果表明經(jīng)過65℃變性處理后的堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物在自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)體內(nèi)具有最明顯的降血壓功效,而α-胰凝乳蛋白酶酶解產(chǎn)物雖然在體外具有最高的ACE抑制活性,但在體內(nèi)只有經(jīng)過腹腔給藥后才能降低SHR動(dòng)脈血壓值,由此可見胃腸道消化酶會(huì)影響水解物中活性肽段的體內(nèi)消化吸收。Lee等用蛋白酶K消化乳清蛋白并采用層析法分離得到6種對(duì)ACE具有抑制作用的肽類片段,分別為Val-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly、Gly-Lys-Pro、Ile-Pro-Ala、Phe-Pro、Val-Tyr-Pro和Thr-Pro-Val-Val-Val-Pro-Pro-Phe-Leu-Gin-Pro,它們主要來源于β-酪蛋白、β-乳球蛋白和乳鐵蛋白等,對(duì)SHR具有明顯的降壓活性。序列分析結(jié)果顯示,脯氨酸和纈氨酸可能是其發(fā)生作用的關(guān)鍵所在。Tsai等首次綜合乳酸菌發(fā)酵法和酶法建立了一種制備乳清蛋白源降壓肽的新方法,能有效提高活性肽的產(chǎn)量。經(jīng)過SephadexG-15凝膠柱和RP-HPLC分離純化后得到ACE抑制活性最高的肽段為Tyr-Pro-Tyr-Tyr,IC50值達(dá)90.9μmol/L,胃腸道能有效吸收,經(jīng)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明其能有效降低SHR的舒張壓(DBP)和收縮壓(SBP),動(dòng)力學(xué)方程研究結(jié)果表明該活性肽的ACE抑制模式是一種競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)的混合抑制模式。2.5乳清蛋白源血糖近年來,國(guó)內(nèi)外已有大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體臨床實(shí)驗(yàn)表明乳清蛋白及其多肽具有明顯的降血糖尤其是降低餐后血糖的功效,餐后血糖的異常升高是心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素之一。根據(jù)目前的研究進(jìn)展,其可能的降血糖機(jī)制主要包括特殊氨基酸構(gòu)成發(fā)揮降血糖效能、增加促胰島素釋放激素釋放、提高胰島素敏感性和增加腹飽感這四個(gè)方面。2009年,Petersen等對(duì)10名健康志愿者進(jìn)行實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)乳清蛋白源血糖指數(shù)降低多肽(GILP)添加到葡萄糖飲料中經(jīng)口服后能明顯降低血糖指數(shù),表明GILP能促進(jìn)胰島素分泌,且食品基質(zhì)中蛋白和碳水化合物相結(jié)合能增強(qiáng)胰島素反應(yīng)。Gunnarsson等用乳清蛋白(WP)對(duì)雌性C57BL/6J小鼠進(jìn)行灌胃(75mg/只),餐后2h內(nèi)小鼠血糖明顯降低,且小鼠血漿中葡萄糖依賴性促胰島素釋放肽(glucose-dependentinsulinotropicpeptide,GIP)和胰高血糖素樣肽-l(glucagons-likepeptide-1,GLP-1)水平顯著增加,而GIP和GLP-1能促進(jìn)胰島β細(xì)胞釋放胰島素而發(fā)揮降血糖作用。Blouet等研究表明用富含α-La營(yíng)養(yǎng)混懸液喂食雄性Wistar大鼠,其餐后2h內(nèi)其血糖明顯低于其他蛋白配方飲食組大鼠的血糖,該研究中還表明增加攝入半胱氨酸或者添加α-LA都能抑制餐后血糖上升。Fird對(duì)14名Ⅱ型糖尿病患者進(jìn)行實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)WP能降低其早餐后2h和午餐后3h內(nèi)的血糖升高程度,此外,WP能增強(qiáng)Ⅱ型糖尿病病人餐后胰島素反應(yīng),并提高血中GIP和GLP-1的水平。2.6醇肽的活性和作用相對(duì)于具有降血壓、抗氧化等生理功能的食品蛋白源生物活性肽來說,降膽固醇食品蛋白源生物活性肽單體分離及其作用機(jī)理的研究相對(duì)較少。目前已有很多研究表明大豆食品源蛋白的酶解產(chǎn)物對(duì)動(dòng)物血清膽固醇水平有較大影響,且主要集中于大豆蛋白和酪蛋白,而關(guān)于牛乳清蛋白源生物活性肽對(duì)血液膽固醇水平的影響的研究則相對(duì)較少。盡管如此,乳清蛋白源降膽固醇肽仍具有潛在的研究?jī)r(jià)值。Nagaoka通過小鼠實(shí)驗(yàn)表明,牛乳清蛋白源生物活性肽比大豆蛋白或酪蛋白具有更強(qiáng)的降低血液膽固醇的活性,并從β-乳球蛋白的胰蛋白酶酶解液中成功地分離出一種五肽IIAGLf(71-75),通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明此肽能明顯降低血清膽固醇水平,其活性甚至大于β-谷甾醇(一種降膽固醇藥物)。Nagaoka還采用Caco-2細(xì)胞及活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究了Ile-Ile-A1a-Glu-Lys影響膽固醇吸收的機(jī)理,結(jié)果表明Ile-Ile-A1a-Glu-Lys具有結(jié)合牛磺膽酸的能力和降低乳糜微粒膽固醇溶解度的作用。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)乳清蛋白源降膽固醇肽的實(shí)體功效,高學(xué)飛于2006年通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明經(jīng)CM-SephadexC50層析分離得到的分子量在1000～12000Da的具有較高三羥基三甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzymeAreductase,HMG-CoA還原酶)抑制活性的乳清蛋白肽,不僅能顯著降低血液中膽固醇、甘油三酯水平,減小動(dòng)脈硬化指數(shù),還具有促進(jìn)生長(zhǎng)、顯著降低脂肪沉積的生物活性。3乳清蛋白及活性肽總之,乳清蛋白源生物活性肽來源于天然乳清蛋白,雖然在乳中的含量不高,但卻具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、食用安全性及生理保健功能,在促進(jìn)機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)育和疾病防治等方面都起著重要的作用,可作為功能性食品或食品添加劑乃至藥品應(yīng)用到人們?nèi)粘Ｉ钪?。目?市場(chǎng)上應(yīng)用乳清蛋白及其活性肽的產(chǎn)品有:強(qiáng)化α-乳白蛋白或乳鐵蛋白的嬰兒配方奶粉、降低嬰兒過敏反應(yīng)的嬰兒配方奶粉、添加了活性增長(zhǎng)因子的醫(yī)用配方營(yíng)養(yǎng)奶粉、含有IgG或乳鐵蛋白的防齲齒產(chǎn)品、在酸奶中添加乳鐵蛋白的骨骼健康產(chǎn)品、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成的營(yíng)養(yǎng)運(yùn)動(dòng)產(chǎn)品以及添加降血壓肽的發(fā)酵乳產(chǎn)品等。近年來國(guó)內(nèi)外對(duì)乳清蛋白及其活性肽的生物學(xué)特性進(jìn)行了廣泛研究,越來越多的生物活性功能肽走進(jìn)人們的視野,然而與日本及歐美發(fā)達(dá)國(guó)家已有的幾十年研究經(jīng)驗(yàn)相比,我國(guó)在這方面的研究起步較晚,隨著現(xiàn)代分離、提取、檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展,對(duì)其研究必將日趨成熟和深入。乳清蛋白中潛在生物活性肽片段可以借助特定的酶或改變遺傳性狀的微生物釋放出來,為其進(jìn)