煙草組培苗實(shí)驗(yàn)步驟

煙草葉片的組織培養(yǎng)一、實(shí)驗(yàn)原理與實(shí)驗(yàn)步驟在植物組織培養(yǎng)中，主要目標(biāo)是誘導(dǎo)愈傷組織形成和形態(tài)發(fā)生，使一個(gè)離體的細(xì)胞、一塊組織或一個(gè)器官的細(xì)胞，通過脫分化形成愈傷組織，并由愈傷組織再分化形成植物體。從一塊外植體形成典型的愈傷組織，大致要經(jīng)歷三個(gè)時(shí)期：起動(dòng)期、分裂期和形成期。植物材料：煙草植株藥品：（2,4-D、NAA、6-BA濃度均可）、1mol/LNaOH、1mol/LHCL蒸餾水、70%酒精0.01%升汞儀器：玻璃杯

、玻璃棒、pH試紙(5.5-9.0)

、1瓶無菌水、1個(gè)無菌燒杯、1包無菌濾紙、

1個(gè)無菌白瓷板

、

培養(yǎng)瓶若干

移液器、

微波爐、

滅菌器、

超凈工作臺(tái)、

酒精燈、

解剖刀、

鑷子二、實(shí)驗(yàn)方法與步驟1、MS培養(yǎng)基母液的配制母液成分規(guī)定量(mg/L)濃縮倍數(shù)稱取量（mg）母液定溶體積（ml）配1LMS培養(yǎng)基吸取量（ml）編號(hào)種類1大量元素KNO319001019000100010NH4NO3

16501016500MgSO4·7H2O3701037000KH2PO41701017002CaCl2·2H2O4401044001000103微量元素MnSO4·4H2O22.31002230100010ZnSO4·7H2O8.6100860H3BO36.2100620KI0.8310083Na2MoO4·7H2O0.2510025CuSO4.5H2O40.0251002.5CoCL2.6H2O0.0251002.54鐵鹽Na2-EDTA37.31003730100010FeSO4.4H2O27.810027805有機(jī)物甘氨酸2.05010050010鹽酸吡哆醇0.55025鹽酸硫銨素0.1505煙酸0.550256肌酸10050500050010注意：1、大量元素按照使用時(shí)高10倍的數(shù)值稱取，分別將各種化合物稱量后，除CaCl2·2H2O單獨(dú)配制外，其余化合物混合在500ml燒杯中加適量蒸餾水溶解，用玻璃棒攪拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，置小口瓶中保存，貼上標(biāo)簽注明化合物名稱（或編號(hào)），濃縮倍數(shù)，配制日期和配制者姓名，CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。

2、微量元素母液的配制按要求濃縮100倍的數(shù)值稱取，分別將各種化合物稱量除鐵鹽（FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O）作為一組單獨(dú)配制外，其余化合物可混合置于燒杯內(nèi)加少量蒸餾水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，貼上標(biāo)簽3、鐵鹽配制將FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O分別溶于450ml蒸餾水中，加熱，（很重要）不斷攪拌，溶解后，兩液混合，調(diào)PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，貼上標(biāo)簽。

4、有機(jī)物母液配制，按母液要求濃縮50倍，除蔗糖按3%單獨(dú)臨時(shí)稱量外，其余分別稱量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，貼上標(biāo)簽。

5．母液最好在2~4℃的冰箱中貯存，特別是有機(jī)類物質(zhì)，貯存時(shí)間不宜過長(zhǎng)，無機(jī)鹽母液最好在一個(gè)月內(nèi)用完，如發(fā)現(xiàn)有霉菌和沉淀產(chǎn)生，就不能再使用。

（1）

制備母液和營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基時(shí)，所用蒸餾水或無離子水必須符合標(biāo)準(zhǔn)要求，化學(xué)藥品必須是高純度的（分析純）。（2）

稱量藥物采用高靈敏度的天平，每種藥品專用一藥匙。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑母液配制：

為了操作方便，節(jié)約時(shí)間，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑也可如同配制母液一樣，先配成原液，這樣配制培養(yǎng)基時(shí)只要稍加計(jì)算，按需要量取即可。

不同藥品在配制時(shí)若不溶于水，可用少量不同的溶劑先溶解，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA3），2，4-D等生長(zhǎng)素和玉米素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加熱。激動(dòng)素（KT）和6-芐基嘌呤（BA）可溶于少量1mol/L的鹽酸中，葉酸需用少量稀氨水溶解。

稱取50mg生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，溶解后，在100ml的容量瓶中定容，配制的母液每毫升則含有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)0.5mg，配制后一般要求在低溫（0~4℃）保存，配制培養(yǎng)基時(shí)如每升（1000ml）需添加的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑物質(zhì)為0.5mg時(shí)，則取1ml母液即可。三、培養(yǎng)基配制和滅菌本次實(shí)驗(yàn)使用

（1）愈傷組織誘導(dǎo)及其幼芽分化培養(yǎng)基:MS+2,4-D

0.5

mg/L

+6-BA

1.0

mg/L；

（2）幼芽增殖培養(yǎng)基：MS+6-BA

1.0

mg/L

+NAA

0.2

mg/L；

（3）生根培養(yǎng)基：MS+NAA

0.2

mg/L。

注意事項(xiàng)：上述培養(yǎng)基均在MS固體培養(yǎng)基溶化后降低到50左右后，加入相應(yīng)激素所得，

MS固體培養(yǎng)基的配置過程在此不作過多贅述

割為1-1.5cm2的小塊；

接入相應(yīng)的MS培養(yǎng)基上，每瓶接種4-5塊。接入（1）中培養(yǎng)。（2）約2～3d后，葉片外植體卷曲、增厚、膨脹；（3）15d后外植體脫分化形成疏松絮狀淺黃綠色的愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率為100%（4）30d后，從葉片外植體產(chǎn)生的疏松愈傷組織上分化出許多淺黃綠色芽點(diǎn)（5）60d后，不僅從愈傷組織上分化出越來越多幼芽，芽誘導(dǎo)頻率(芽數(shù)/塊愈傷組織)為25～35，而且還可觀察到，該愈傷組織較早分化產(chǎn)生的幼芽葉片呈現(xiàn)不同程度白化（或缺綠）。但此時(shí)若將此缺綠幼芽切下，轉(zhuǎn)接至不加2,4-D的幼芽增殖培養(yǎng)基（2）上。（6）3～5d后即可恢復(fù)正常，缺綠癥狀消失，并可不斷增殖，發(fā)育成綠色健壯的小苗。七、誘導(dǎo)生根及移栽與數(shù)據(jù)記錄取約3～4cm長(zhǎng)的無根小苗接種于生根培養(yǎng)基（3）中，約7～8d后，幾乎所有外植體均從其基部產(chǎn)生白色幼根，根誘導(dǎo)頻率為3～5，部分在培養(yǎng)基表面的根具大量白色根毛。當(dāng)試管苗長(zhǎng)至5～6cm高時(shí)，打開瓶口，在散射光下放置2d后取出，洗去根部殘留培養(yǎng)基，種植于經(jīng)過消毒的珍珠巖、泥炭土和菜