調(diào)肝健脾補(bǔ)腎方藥及人參總皂甙對(duì)反復(fù)心理應(yīng)激大鼠中樞h的影響

調(diào)肝健脾補(bǔ)腎方藥及人參總皂甙對(duì)反復(fù)心理應(yīng)激大鼠中樞h的影響

氨基酸羥基酶（th）是促進(jìn)酪氨酸（tyr）合成胺（da）、脫甲基硝胺（ne）和酪氨酸（e）的催化劑，它可以提高和抑制th的活力，并對(duì)caiocontamca的合成產(chǎn)生重大影響。TH作為CA合成的限速酶在應(yīng)激反應(yīng)中具有重要的作用。本實(shí)驗(yàn)采用反復(fù)制動(dòng)限制活動(dòng)空間的方法制成心理應(yīng)激大鼠模型,在此基礎(chǔ)上觀察了應(yīng)激大鼠下丘腦TH和下丘腦及海馬Tyr含量的變化以及調(diào)肝、健脾、補(bǔ)腎方藥及人參總皂甙對(duì)其的影響,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。1材料和方法1.1不同類型中藥的刺激Wistar大鼠,雌雄各半,體重180～220g,正常飲食,在光一暗周期為12h,溫度為(20±2)℃的安靜環(huán)境下飼養(yǎng)7d。按體重隨機(jī)分為6組:正常組(normalgroup),不施加任何刺激;模型組(modelgroup),給予制動(dòng)刺激,不予中藥;調(diào)肝組(liver-regulatingherbgroup),制動(dòng)刺激前給予調(diào)肝方藥;健脾組(spleen-strengtheningherbgroup),制動(dòng)刺激前給予四君子湯;補(bǔ)腎組(kidney-tonifyingherbgroup),制動(dòng)刺激前給予腎氣丸;人參總皂甙組(ginsenosidegroup),制動(dòng)刺激前給予人參總皂甙。1.2藥材、藥品、制劑:四君子湯、人參皂茯苓液的制備組采用雞病調(diào)肝方藥組成及劑量:柴胡5g、白芍15g、枳殼6g、枸杞子15g、山梔子5g、干地黃18g、石決明30g。腎氣丸組成及劑量:干地黃30g、山藥15g、山茱萸15g、澤瀉10g、茯苓10g、丹皮10g、桂枝4g、附子4g。四君子湯組成及劑量:黨參20g、白術(shù)15g、茯苓15g、炙甘草6g。藥材由本校第一附屬醫(yī)院藥房提供,經(jīng)藥劑科鑒定均為純正藥材,常規(guī)煎煮取汁后,調(diào)肝方藥濃縮至含生藥1.69g/mL,四君子湯濃縮至含生藥1.01g/mL,腎氣丸濃縮至含生藥1.76g/mL(用藥劑量為成年人70kg體重劑量的10倍)。高壓滅菌,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ藚⒖傇磉坝砷L春白求恩醫(yī)科大學(xué)藥劑科提供,配制成水溶液7mg/mL。調(diào)肝組、補(bǔ)腎組、健脾組及人參總皂甙組均于制動(dòng)刺激前1h相應(yīng)給予調(diào)肝方藥、腎氣丸、四君子湯及人參總皂甙溶液2mL灌胃,正常組及模型組以2mL生理鹽水灌服。1.3大鼠制動(dòng)期間禁水時(shí)間采用限制制動(dòng)的方法建立慢性心理應(yīng)激反應(yīng)模型。將造模大鼠置于自制的限制制動(dòng)筒內(nèi)(由大鼠固定儀改制而成),通過移動(dòng)插片而逐步縮小大鼠的活動(dòng)空間,調(diào)節(jié)到其不產(chǎn)生強(qiáng)烈反抗的緊張程度,每日限制制動(dòng)1次,每日開始時(shí)間及限制制動(dòng)時(shí)間不同,第1天為4h,其后每次增加30～60min,連續(xù)14d。造模大鼠在制動(dòng)期間禁食、禁水。造模結(jié)束后在動(dòng)物清醒、安靜狀態(tài)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.4指標(biāo)和方法的檢測1.4.1th抗體檢測一抗:羊抗鼠THGoatpolyclonalIgG(N-15,Cat#SC-2848,Lot-1060)購自Sigma公司,經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定TH抗體血清稀釋度為1:250～1:200。二抗:Donkeyanti-goat購自基因公司。ABC染色試劑盒購自基因公司;DAB顯色劑購自武漢博士得公司;其他液體:40g/L多聚甲醛(0.01mol的PBS液配制,pH=7.4);0.9g/L生理鹽水;30mg/mL戊巴比妥鈉溶液;PBS液(pH=7.4);0.01mol枸櫞酸鈉等。1.4.2機(jī)圖像分析方法上海江灣Ⅱ型大鼠腦立體定位儀;TABPlus計(jì)算機(jī)圖像分析儀;美國惠普HP-1050型高效液相色譜儀,配HP-1050型四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器,HP-1046A型熒光檢測器和HPLC-2D色譜工作站。1.4.3測試指標(biāo)下丘腦TH免疫組織化學(xué)觀察采用ABC法,DAB染色。下丘腦與海馬Tyr含量檢測采用OPA柱前衍生反相高效液相色譜法。1.5方法1.5.1超聲波輔助提取大鼠稱重,斷頭,迅速取全腦,于冰盤上分離下丘腦和海馬,電子天平稱重記錄。將下丘腦和海馬分別置于玻璃勻漿器內(nèi),加入3mL甲醇,冰浴內(nèi)充分勻漿,用毛細(xì)吸管將提取液轉(zhuǎn)移至25mL離心管中,用2mL甲醇再提取2次,合并3次提取液,總計(jì)約7～8mL。搖勻,置超聲波上處理30min,10000r/min冷凍離心30min,將上清液轉(zhuǎn)入20mL小瓶中。80℃水溫水浴至甲醇蒸發(fā)至干,在瓶內(nèi)加入5.0ml/LHCl,置超聲波處理30min。在超聲波處理過程中,小心搖動(dòng)小瓶,使氨基酸成分溶出,將溶出物轉(zhuǎn)入10mL離心管中,10000r/min冷凍離心30min,取上清液,用于氨基酸分析。1.5.2腦內(nèi)定位儀定位大鼠戊巴比妥鈉(55mg/kg)深度麻醉,劍突下剪開皮膚、肋骨,沿心尖刺入左心室,沿主動(dòng)脈方向?qū)⒐嗔麽橆^刺入主動(dòng)脈,以止血鉗固定心臟和灌流針,剪開右心耳,快速灌注37℃生理鹽水250mL,直至流出的液體澄清無血為止。繼之快速灌注4℃40g/L多聚甲醛250～300mL。直到大鼠肢體無刺激癥狀為止,每只大鼠利用江灣Ⅱ型腦立體定位儀定位,具體位置為:經(jīng)耳中線距嘴側(cè)5.8～5.6cm的經(jīng)杏仁海馬區(qū)冠狀切面上。沿此冠狀切面(肉眼:起始切片位置應(yīng)該在視交叉后部)開顱取腦,將腦置入同樣的40g/L多聚甲醛溶液中進(jìn)行外固定48h。48h后,取出腦組織在室溫下梯度酒精脫水,氯仿透明,石蠟包埋。切片厚4μm,隔5張連續(xù)留2張切片,使用序號(hào)做好標(biāo)記,每只大鼠共計(jì)留20張片。每張載玻片留2張腦切片,左右各一。左側(cè)為實(shí)驗(yàn)片(滴加一抗片),右側(cè)為對(duì)照片(一抗以PBS代替,其余步驟均同)。每張切片作好標(biāo)記。1.5.3血小板和牛毛,木素,蘇.木常規(guī)石蠟切片,PBS液洗3次,每次5min。置切片于0.01mol枸櫞酸鈉(pH=6.0)中,微波爐內(nèi)中檔火95～100℃條件下烘干5min。取出后室溫涼至40℃。PBS液洗2次,每次5min。每張切片滴加一滴封閉血清,室溫下孵育20～30min。甩掉未結(jié)合的液體。實(shí)驗(yàn)側(cè)每張切片滴加50μL或者1滴一抗,4℃過夜。對(duì)照側(cè)切片滴加等量的PBS液。過夜后,PBS液沖洗3次,每次5min。每張切片滴加生物素標(biāo)記的二抗,室溫下孵育30～40min。PBS沖洗3次,每次5min。每張切片滴加1滴AB反應(yīng)物溶液,室溫下孵育40min。PBS洗3次,每次5min。加入過氧化物底物,孵育1～3min,鏡下觀察,蒸餾水沖洗,終止染色。蘇木素復(fù)染,10～15s,慢速流水沖洗,自然風(fēng)干,中性樹脂膠封固。免疫組化空白對(duì)照實(shí)驗(yàn):用PBS代替一抗孵育切片,結(jié)果陰性。1.5.4數(shù)麻黃th陽性細(xì)胞用于光鏡觀察的切片在10×20倍數(shù)下按Paxinos和Watson腦圖譜,由吻—尾側(cè)方向計(jì)數(shù)下丘腦TH陽性細(xì)胞。TH陽性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞呈菱星狀成簇分布,陽性纖維呈條帶狀,免疫反應(yīng)產(chǎn)物為棕紅色,染色均勻,分布于胞體和細(xì)胞突起。以見到胞核斷面為有效計(jì)數(shù),在顯微鏡下,用微尺測定細(xì)胞的最大直徑,根據(jù)光密度值,經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像分析儀數(shù)出強(qiáng)陽性細(xì)胞數(shù)(被計(jì)數(shù)的細(xì)胞有細(xì)胞核)。1.6統(tǒng)計(jì)處理所有結(jié)果以表示,采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1th陽性細(xì)胞的變化表1結(jié)果顯示,模型組大鼠下丘腦弓狀核、腹內(nèi)側(cè)核、背內(nèi)側(cè)核、室旁核以及室周核均有TH陽性細(xì)胞以及陽性纖維出現(xiàn),尤以弓狀核與下丘腦腹內(nèi)側(cè)核TH陽性細(xì)胞明顯增多(P<0.01)。調(diào)肝方藥可明顯增加兩核TH陽性細(xì)胞數(shù)(P<0.01),腎氣丸對(duì)兩核TH陽性細(xì)胞數(shù)量無明顯影響,四君子湯和人參總皂甙有明顯上調(diào)兩核TH陽性細(xì)胞數(shù)量的作用(P<0.01)。2.2各組小鼠海馬tyr比較表2結(jié)果顯示,模型組下丘腦與海馬Tyr無明顯變化。與模型組相比,調(diào)肝組、健脾組與人參總皂甙組下丘腦Tyr明顯下降(P<0.01);補(bǔ)腎組與健脾組海馬Tyr水平則明顯升高(P<0.01)。提示4組中藥對(duì)于調(diào)節(jié)反復(fù)心理應(yīng)激大鼠中樞Tyr機(jī)制具有相同之處。3不同中藥對(duì)小鼠海馬tyr、da在應(yīng)激狀態(tài)下,在下丘腦許多核團(tuán)如室周核、弓狀核和腹內(nèi)側(cè)核等區(qū)域有廣泛的TH表達(dá)。TH存在于腎上腺素能、多巴胺能神經(jīng)元和腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞的胞漿內(nèi)。各種應(yīng)激均可以導(dǎo)致中樞TH表達(dá)增強(qiáng),TH蛋白合成增多。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),在反復(fù)制動(dòng)心理應(yīng)激大鼠下丘腦弓狀核、腹內(nèi)側(cè)核、背內(nèi)側(cè)核、室旁核以及室周核均有TH陽性細(xì)胞以及陽性纖維出現(xiàn),尤其下丘腦弓狀核和下丘腦腹內(nèi)側(cè)核的陽性細(xì)胞和陽性纖維數(shù)量明顯超過正常組?？梢?本實(shí)驗(yàn)的反復(fù)制動(dòng)心理應(yīng)激大鼠下丘腦弓狀核和腹內(nèi)側(cè)核的TH細(xì)胞功能活動(dòng)明顯增強(qiáng)。結(jié)合下丘腦Tyr含量無明顯改變,推測可能是Tyr含量豐富,相對(duì)于TH細(xì)胞增強(qiáng)的功能活動(dòng)而言,并沒有顯得不足。應(yīng)用中藥對(duì)慢性心理應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)行調(diào)控的研究報(bào)道較少,心理應(yīng)激反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)是神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)(neuroendocrine-immunomodulation,NIM)網(wǎng)絡(luò)。盡管目前已有許多研究表明調(diào)肝、健脾、補(bǔ)腎方藥以及人參總皂甙對(duì)NIM網(wǎng)絡(luò)具有調(diào)節(jié)作用,但作用機(jī)理不盡相同,特別是從心理應(yīng)激角度而言,不同方藥的中樞作用機(jī)理尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn),調(diào)肝、健脾方藥及人參總皂甙均可明顯增加下丘腦兩核TH陽性細(xì)胞數(shù),由此提示,上述方藥可通過增強(qiáng)TH功能,進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體應(yīng)對(duì)應(yīng)激的能力。而補(bǔ)腎方藥似乎對(duì)下丘腦TH無顯著影響,這有待進(jìn)一步研究。此外,本次實(shí)驗(yàn)及以往研究發(fā)現(xiàn),調(diào)肝方藥可使應(yīng)激大鼠下丘腦Tyr含量明顯下降(P<0.01),對(duì)海馬具有下降趨勢的Tyr也具有一定的上調(diào)作用,與正常對(duì)照組相比無顯著性差異。腎氣丸對(duì)下丘腦Tyr具有下調(diào)趨勢,但可明顯提高海馬Tyr水平,并超過正常對(duì)照組(P<0.01),其具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步探討。四君子湯可明顯降低下丘腦Tyr(P<0.01),升高海馬Tyr水平(P<0.01)。人參總皂甙被廣泛地應(yīng)用于抗應(yīng)激損傷,從中醫(yī)理論角度而言,人參總皂甙重在培補(bǔ)元?dú)?從而提高機(jī)體抗應(yīng)激的能力。我們研究發(fā)現(xiàn)人參總皂甙可以明顯降低下丘腦Tyr(P<0.01),對(duì)海