調肝健脾補腎方藥及人參總皂甙對反復心理應激大鼠中樞h的影響

調肝健脾補腎方藥及人參總皂甙對反復心理應激大鼠中樞h的影響

氨基酸羥基酶（th）是促進酪氨酸（tyr）合成胺（da）、脫甲基硝胺（ne）和酪氨酸（e）的催化劑，它可以提高和抑制th的活力，并對caiocontamca的合成產(chǎn)生重大影響。TH作為CA合成的限速酶在應激反應中具有重要的作用。本實驗采用反復制動限制活動空間的方法制成心理應激大鼠模型,在此基礎上觀察了應激大鼠下丘腦TH和下丘腦及海馬Tyr含量的變化以及調肝、健脾、補腎方藥及人參總皂甙對其的影響,現(xiàn)將結果報道如下。1材料和方法1.1不同類型中藥的刺激Wistar大鼠,雌雄各半,體重180～220g,正常飲食,在光一暗周期為12h,溫度為(20±2)℃的安靜環(huán)境下飼養(yǎng)7d。按體重隨機分為6組:正常組(normalgroup),不施加任何刺激;模型組(modelgroup),給予制動刺激,不予中藥;調肝組(liver-regulatingherbgroup),制動刺激前給予調肝方藥;健脾組(spleen-strengtheningherbgroup),制動刺激前給予四君子湯;補腎組(kidney-tonifyingherbgroup),制動刺激前給予腎氣丸;人參總皂甙組(ginsenosidegroup),制動刺激前給予人參總皂甙。1.2藥材、藥品、制劑:四君子湯、人參皂茯苓液的制備組采用雞病調肝方藥組成及劑量:柴胡5g、白芍15g、枳殼6g、枸杞子15g、山梔子5g、干地黃18g、石決明30g。腎氣丸組成及劑量:干地黃30g、山藥15g、山茱萸15g、澤瀉10g、茯苓10g、丹皮10g、桂枝4g、附子4g。四君子湯組成及劑量:黨參20g、白術15g、茯苓15g、炙甘草6g。藥材由本校第一附屬醫(yī)院藥房提供,經(jīng)藥劑科鑒定均為純正藥材,常規(guī)煎煮取汁后,調肝方藥濃縮至含生藥1.69g/mL,四君子湯濃縮至含生藥1.01g/mL,腎氣丸濃縮至含生藥1.76g/mL(用藥劑量為成年人70kg體重劑量的10倍)。高壓滅菌,4℃冰箱保存?zhèn)溆?。人參總皂甙由長春白求恩醫(yī)科大學藥劑科提供,配制成水溶液7mg/mL。調肝組、補腎組、健脾組及人參總皂甙組均于制動刺激前1h相應給予調肝方藥、腎氣丸、四君子湯及人參總皂甙溶液2mL灌胃,正常組及模型組以2mL生理鹽水灌服。1.3大鼠制動期間禁水時間采用限制制動的方法建立慢性心理應激反應模型。將造模大鼠置于自制的限制制動筒內(由大鼠固定儀改制而成),通過移動插片而逐步縮小大鼠的活動空間,調節(jié)到其不產(chǎn)生強烈反抗的緊張程度,每日限制制動1次,每日開始時間及限制制動時間不同,第1天為4h,其后每次增加30～60min,連續(xù)14d。造模大鼠在制動期間禁食、禁水。造模結束后在動物清醒、安靜狀態(tài)下進行實驗。1.4指標和方法的檢測1.4.1th抗體檢測一抗:羊抗鼠THGoatpolyclonalIgG(N-15,Cat#SC-2848,Lot-1060)購自Sigma公司,經(jīng)預實驗確定TH抗體血清稀釋度為1:250～1:200。二抗:Donkeyanti-goat購自基因公司。ABC染色試劑盒購自基因公司;DAB顯色劑購自武漢博士得公司;其他液體:40g/L多聚甲醛(0.01mol的PBS液配制,pH=7.4);0.9g/L生理鹽水;30mg/mL戊巴比妥鈉溶液;PBS液(pH=7.4);0.01mol枸櫞酸鈉等。1.4.2機圖像分析方法上海江灣Ⅱ型大鼠腦立體定位儀;TABPlus計算機圖像分析儀;美國惠普HP-1050型高效液相色譜儀,配HP-1050型四元梯度泵、自動進樣器,HP-1046A型熒光檢測器和HPLC-2D色譜工作站。1.4.3測試指標下丘腦TH免疫組織化學觀察采用ABC法,DAB染色。下丘腦與海馬Tyr含量檢測采用OPA柱前衍生反相高效液相色譜法。1.5方法1.5.1超聲波輔助提取大鼠稱重,斷頭,迅速取全腦,于冰盤上分離下丘腦和海馬,電子天平稱重記錄。將下丘腦和海馬分別置于玻璃勻漿器內,加入3mL甲醇,冰浴內充分勻漿,用毛細吸管將提取液轉移至25mL離心管中,用2mL甲醇再提取2次,合并3次提取液,總計約7～8mL。搖勻,置超聲波上處理30min,10000r/min冷凍離心30min,將上清液轉入20mL小瓶中。80℃水溫水浴至甲醇蒸發(fā)至干,在瓶內加入5.0ml/LHCl,置超聲波處理30min。在超聲波處理過程中,小心搖動小瓶,使氨基酸成分溶出,將溶出物轉入10mL離心管中,10000r/min冷凍離心30min,取上清液,用于氨基酸分析。1.5.2腦內定位儀定位大鼠戊巴比妥鈉(55mg/kg)深度麻醉,劍突下剪開皮膚、肋骨,沿心尖刺入左心室,沿主動脈方向將灌流針頭刺入主動脈,以止血鉗固定心臟和灌流針,剪開右心耳,快速灌注37℃生理鹽水250mL,直至流出的液體澄清無血為止。繼之快速灌注4℃40g/L多聚甲醛250～300mL。直到大鼠肢體無刺激癥狀為止,每只大鼠利用江灣Ⅱ型腦立體定位儀定位,具體位置為:經(jīng)耳中線距嘴側5.8～5.6cm的經(jīng)杏仁海馬區(qū)冠狀切面上。沿此冠狀切面(肉眼:起始切片位置應該在視交叉后部)開顱取腦,將腦置入同樣的40g/L多聚甲醛溶液中進行外固定48h。48h后,取出腦組織在室溫下梯度酒精脫水,氯仿透明,石蠟包埋。切片厚4μm,隔5張連續(xù)留2張切片,使用序號做好標記,每只大鼠共計留20張片。每張載玻片留2張腦切片,左右各一。左側為實驗片(滴加一抗片),右側為對照片(一抗以PBS代替,其余步驟均同)。每張切片作好標記。1.5.3血小板和牛毛,木素,蘇.木常規(guī)石蠟切片,PBS液洗3次,每次5min。置切片于0.01mol枸櫞酸鈉(pH=6.0)中,微波爐內中檔火95～100℃條件下烘干5min。取出后室溫涼至40℃。PBS液洗2次,每次5min。每張切片滴加一滴封閉血清,室溫下孵育20～30min。甩掉未結合的液體。實驗側每張切片滴加50μL或者1滴一抗,4℃過夜。對照側切片滴加等量的PBS液。過夜后,PBS液沖洗3次,每次5min。每張切片滴加生物素標記的二抗,室溫下孵育30～40min。PBS沖洗3次,每次5min。每張切片滴加1滴AB反應物溶液,室溫下孵育40min。PBS洗3次,每次5min。加入過氧化物底物,孵育1～3min,鏡下觀察,蒸餾水沖洗,終止染色。蘇木素復染,10～15s,慢速流水沖洗,自然風干,中性樹脂膠封固。免疫組化空白對照實驗:用PBS代替一抗孵育切片,結果陰性。1.5.4數(shù)麻黃th陽性細胞用于光鏡觀察的切片在10×20倍數(shù)下按Paxinos和Watson腦圖譜,由吻—尾側方向計數(shù)下丘腦TH陽性細胞。TH陽性細胞表現(xiàn)為細胞呈菱星狀成簇分布,陽性纖維呈條帶狀,免疫反應產(chǎn)物為棕紅色,染色均勻,分布于胞體和細胞突起。以見到胞核斷面為有效計數(shù),在顯微鏡下,用微尺測定細胞的最大直徑,根據(jù)光密度值,經(jīng)計算機圖像分析儀數(shù)出強陽性細胞數(shù)(被計數(shù)的細胞有細胞核)。1.6統(tǒng)計處理所有結果以表示,采用SPSS統(tǒng)計軟件進行方差分析和t檢驗。2結果2.1th陽性細胞的變化表1結果顯示,模型組大鼠下丘腦弓狀核、腹內側核、背內側核、室旁核以及室周核均有TH陽性細胞以及陽性纖維出現(xiàn),尤以弓狀核與下丘腦腹內側核TH陽性細胞明顯增多(P<0.01)。調肝方藥可明顯增加兩核TH陽性細胞數(shù)(P<0.01),腎氣丸對兩核TH陽性細胞數(shù)量無明顯影響,四君子湯和人參總皂甙有明顯上調兩核TH陽性細胞數(shù)量的作用(P<0.01)。2.2各組小鼠海馬tyr比較表2結果顯示,模型組下丘腦與海馬Tyr無明顯變化。與模型組相比,調肝組、健脾組與人參總皂甙組下丘腦Tyr明顯下降(P<0.01);補腎組與健脾組海馬Tyr水平則明顯升高(P<0.01)。提示4組中藥對于調節(jié)反復心理應激大鼠中樞Tyr機制具有相同之處。3不同中藥對小鼠海馬tyr、da在應激狀態(tài)下,在下丘腦許多核團如室周核、弓狀核和腹內側核等區(qū)域有廣泛的TH表達。TH存在于腎上腺素能、多巴胺能神經(jīng)元和腎上腺髓質嗜鉻細胞的胞漿內。各種應激均可以導致中樞TH表達增強,TH蛋白合成增多。本實驗研究發(fā)現(xiàn),在反復制動心理應激大鼠下丘腦弓狀核、腹內側核、背內側核、室旁核以及室周核均有TH陽性細胞以及陽性纖維出現(xiàn),尤其下丘腦弓狀核和下丘腦腹內側核的陽性細胞和陽性纖維數(shù)量明顯超過正常組?？梢?本實驗的反復制動心理應激大鼠下丘腦弓狀核和腹內側核的TH細胞功能活動明顯增強。結合下丘腦Tyr含量無明顯改變,推測可能是Tyr含量豐富,相對于TH細胞增強的功能活動而言,并沒有顯得不足。應用中藥對慢性心理應激反應進行調控的研究報道較少,心理應激反應的物質基礎是神經(jīng)內分泌免疫調節(jié)(neuroendocrine-immunomodulation,NIM)網(wǎng)絡。盡管目前已有許多研究表明調肝、健脾、補腎方藥以及人參總皂甙對NIM網(wǎng)絡具有調節(jié)作用,但作用機理不盡相同,特別是從心理應激角度而言,不同方藥的中樞作用機理尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn),調肝、健脾方藥及人參總皂甙均可明顯增加下丘腦兩核TH陽性細胞數(shù),由此提示,上述方藥可通過增強TH功能,進而增強機體應對應激的能力。而補腎方藥似乎對下丘腦TH無顯著影響,這有待進一步研究。此外,本次實驗及以往研究發(fā)現(xiàn),調肝方藥可使應激大鼠下丘腦Tyr含量明顯下降(P<0.01),對海馬具有下降趨勢的Tyr也具有一定的上調作用,與正常對照組相比無顯著性差異。腎氣丸對下丘腦Tyr具有下調趨勢,但可明顯提高海馬Tyr水平,并超過正常對照組(P<0.01),其具體機制還有待于進一步探討。四君子湯可明顯降低下丘腦Tyr(P<0.01),升高海馬Tyr水平(P<0.01)。人參總皂甙被廣泛地應用于抗應激損傷,從中醫(yī)理論角度而言,人參總皂甙重在培補元氣,從而提高機體抗應激的能力。我們研究發(fā)現(xiàn)人參總皂甙可以明顯降低下丘腦Tyr(P<0.01),對海