微生物檢驗(yàn)1619章螺旋體

第十六章螺旋體Spirochete中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院李登清螺旋體（spirochete)：是一種細(xì)長(zhǎng)、柔軟、螺旋狀、運(yùn)動(dòng)活潑的原核細(xì)胞型微生物。生物學(xué)上的地位介于細(xì)菌與原蟲(chóng)之間。分類學(xué)上劃歸廣義的細(xì)菌學(xué)范疇。

形態(tài)結(jié)構(gòu)

形態(tài)：為一群細(xì)長(zhǎng)、柔軟、螺旋狀運(yùn)動(dòng)活潑的原核細(xì)胞型微生物，屬細(xì)菌范疇。

結(jié)構(gòu)與性狀：基本結(jié)構(gòu)與細(xì)菌類似，有細(xì)胞壁(含脂多糖與磷壁酸)，原始核，有核質(zhì)，以二分裂方式繁殖，對(duì)抗生素敏感。

形態(tài)與結(jié)構(gòu)

螺旋體形態(tài)結(jié)構(gòu)圖特點(diǎn)：染色著色困難—

常用暗視野，軸絲伸縮而運(yùn)動(dòng)

分類

依據(jù)其大小、螺旋數(shù)目、螺旋規(guī)則程度和間距分為：1目3科13個(gè)屬。螺旋體目

Spirochaetales1、螺旋體科Spirochaetaceae分9個(gè)屬：

疏螺旋體屬（Borrelia）、密螺旋體屬（Treponema）等。2、蛇形螺旋體科Serpulinaceae分2個(gè)屬3、鉤端螺旋體科

Leptospiraceae，分2個(gè)屬：鉤端螺旋體屬（Leptospira）和細(xì)絲體屬（Leptonema）。致病者有以下3屬疏螺旋體屬（Borrelia)：伯氏疏螺旋體，回歸熱螺旋體

致病：萊姆病、回歸熱鉤端螺旋體屬（Leptospira）：?jiǎn)柼?hào)狀鉤端螺旋體；

致?。恒^體病

密螺旋體屬（Treponema）：梅毒螺旋體；

致?。好范俱^端螺旋體密螺旋體疏螺旋體第一節(jié)鉤端螺旋體

是引起自然疫源性急性傳染病、鉤端螺旋體病的病原體，主要是問(wèn)號(hào)狀鉤端螺旋體。為人獸共患病。

（引起人類這類疾病的病原體，不是人類本身固有的，而是來(lái)源于自然界動(dòng)物。由這類病原體引起人類的疾病，統(tǒng)稱為自然疫源性疾病）

一、臨床意義

問(wèn)號(hào)狀鉤端螺旋體，具有較強(qiáng)的致病性（毒素、酶類），致鉤端螺旋體病。引起鉤體病帶菌（問(wèn)號(hào)狀鉤端螺旋體）的動(dòng)物，世界上己發(fā)現(xiàn)200多種動(dòng)物攜帶此菌，我國(guó)有50多種動(dòng)物攜帶，主要是黑線姬鼠等鼠類和豬是常見(jiàn)的儲(chǔ)存宿主，雞鴨鵝兔、蛇蛙等也為儲(chǔ)存宿主。（一）致病物質(zhì)

1.內(nèi)毒素樣物質(zhì)(ELS)

細(xì)胞壁中含類似脂多糖物質(zhì)（LLS），引起的病理變化與典型的內(nèi)毒素相似，只是毒性較低。2.溶血素

波摩那型、犬型、七日熱型產(chǎn)生溶血素，破壞紅細(xì)胞膜而溶血。

溶血素不耐熱，56℃經(jīng)30分鐘失活，對(duì)氧穩(wěn)定，可被胰蛋白酶破壞。

3.細(xì)胞毒性因子(CTF)注射小鼠，可出現(xiàn)肌肉痙攣、呼吸困難而死亡。4.細(xì)胞致病作用（CPE）物質(zhì)

引起細(xì)胞退行性病變；注射家兔，可形成紅斑和水腫。（二）所致疾病

鉤端螺旋體病

人獸共患傳染病，多宿主（鼠和豬為主），傳播途徑有：主要為接觸傳播。

?人與污染水或土壤接觸

?黏膜或皮膚侵入

?消化道黏膜（污染食物/飲水）

?胎盤(pán)垂直傳播

?吸血昆蟲(chóng)流行特點(diǎn)季節(jié)性（夏秋）：洪水型—豬，

稻田型—鼠

雨水型—豬與犬地區(qū)性：

三多－鼠、豬、水職業(yè)性：

農(nóng)民、礦工、飼養(yǎng)員

帶菌動(dòng)物污染環(huán)境（水、土壤）損傷的皮膚或粘膜血、淋巴系統(tǒng)全身毛細(xì)血管內(nèi)皮損傷并伴有循環(huán)障礙鉤體血癥CNS、心、肺、

腎、肝功能受損中毒癥狀尿致病性

先形成鉤體血癥，損傷全身毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及肝、腎、肺心及中樞神經(jīng)等多器官損傷，出現(xiàn)休克、DIC、黃疸、出血、心腎功能不全、腦膜炎等。臨床特點(diǎn)

起病急，高熱、乏力、全身酸痛、結(jié)膜充血、腓腸肌壓痛、表淺淋巴結(jié)腫大；

三大癥狀：寒熱、身痛、一身乏

三大體征：眼紅、腿疼、淋巴大免疫性

體液免疫為主，病后獲得對(duì)同型鉤體的持久免疫力。附表鉤體病主要流行類型及特點(diǎn)

稻田型雨水型洪水型

主要傳染源鼠類豬與犬豬

主要菌群黃疸出血群波摩那群波摩那群

傳播因素鼠尿污染暴雨積水洪水淹沒(méi)

感染地區(qū)稻田、水塘地勢(shì)低洼村落洪水泛濫區(qū)

發(fā)病情況較集中分散較集中

國(guó)內(nèi)地區(qū)南方水稻耕作區(qū)北方和南方北方和南方

臨床類型流感傷寒型流感傷寒型流感傷寒型

黃疸出血型少數(shù)腦膜炎型

肺出血型

臨床表現(xiàn)

Clinicalfeature1、早期（敗血癥期，流感傷寒型）

類似感冒，起病多急驟。（1）發(fā)熱：T>39℃，熱程1周±。（2）全身酸痛：頭、腓腸肌、腰肌為著。（3）全身軟弱無(wú)力。（4）結(jié)膜充血：輕者眼結(jié)膜充血，重者膜下出血。（5）淺表淋巴結(jié)腫大等。本期持續(xù)5-10天，絕大部分病例此時(shí)鉤體自血液及腦脊液中消失。結(jié)膜充血—眼紅結(jié)膜網(wǎng)狀充血

結(jié)膜下出血end2、中期（內(nèi)臟損害期，病死率高）（1）肺出血型：頗為常見(jiàn)。

以全身毒血癥狀及輕重不一的咯血為特征。（2）黃疸出血型（3）腦膜腦炎型

（4）腎病功能衰竭型（5）休克、DIC等

3、后期（恢復(fù)期）：

后發(fā)熱，閉塞性腦動(dòng)脈炎，葡萄膜炎

預(yù)防原則：

1、防鼠、滅鼠，加強(qiáng)對(duì)帶菌家畜的管理

2、接種多價(jià)鉤體疫苗：在常年流行地區(qū)，對(duì)易感人群和與疫水接觸者宜接種包含當(dāng)?shù)亓餍兄暝趦?nèi)的多價(jià)鉤端螺旋體疫苗。防治原則預(yù)防接種

多價(jià)鉤體菌苗

(鉤體疫苗為全菌死疫苗)

對(duì)象

:重點(diǎn)流行區(qū)人群(禁忌癥除外);一般流行區(qū),主要是需接觸疫水者;新入疫區(qū)者,疫區(qū)兒童、飼養(yǎng)員、屠宰人員。

時(shí)間:流行前l(fā)個(gè)月,多在4月底至5月初完成。

方法:每年兩次皮下注射，第一次lml第2次2ml，間隔7～l0天。兒童劑量減半。濃縮菌苗劑量減半。

接種反應(yīng)

:接種后l月左右產(chǎn)生免疫力，保持約l年。

預(yù)防治療

對(duì)進(jìn)入疫區(qū)短期工作的高危人群，可服強(qiáng)力霉素預(yù)防，0.2，每周l次。對(duì)高度懷疑已受鉤體感染但尚無(wú)明顯癥狀者，可每日肌注青霉素80萬(wàn)～l20萬(wàn)U，連續(xù)2～3天。治療原則

三早一就地原則,即早期發(fā)現(xiàn),早期診斷,早期治療,就地或就近治療。

1、一般治療臥床休息,給予高熱量、易消化食物,保持水和電解質(zhì)平衡,高熱酌于物理降溫,加強(qiáng)病情觀察與護(hù)理。

2、病原治療殺滅病原菌是治療的關(guān)鍵和根本措施,應(yīng)早期應(yīng)用有效抗生素,鉤體對(duì)青霉素、慶大霉素、

四環(huán)素等敏感。

青霉素首選，注意赫氏反應(yīng)。（1）青霉素

為首選藥物常用劑量為40萬(wàn)U,6~8小時(shí)l次,肌注,療程7天,或至熱退后3天。由于可能發(fā)生赫氏反應(yīng),有人主張以小劑量開(kāi)始,首劑5萬(wàn)U,4小時(shí)后l0萬(wàn)U,逐漸過(guò)渡到40萬(wàn)U或在應(yīng)用青霉素的同時(shí)靜滴氫化可的松200mg。赫氏反應(yīng)是青霉素治療后的一種加重反應(yīng),一般在首劑后半小時(shí)至4小時(shí)內(nèi)發(fā)生。表現(xiàn)為患者突然出現(xiàn)寒戰(zhàn)高熱頭痛全身痛心率和呼吸加快,原有癥狀加重;部分病人可出現(xiàn)體溫驟降,四肢厥冷,持續(xù)30分鐘至l小時(shí);也可誘發(fā)肺彌漫性出血,導(dǎo)致病人死亡,應(yīng)高度重視。赫氏反應(yīng)是由于大量鉤體被青霉素殺滅后釋放毒素所致,當(dāng)青霉素劑量較大時(shí)容易發(fā)生,故首劑宜小和分次給藥。

赫氏反應(yīng)(Herxheimerreaction)。（2）慶大霉素

青霉素過(guò)敏者可改用慶大,8萬(wàn)單位肌注,每8小時(shí)l次,療程同青霉素。

3、對(duì)癥治療

對(duì)于病情較重的病人均宜常規(guī)給予鎮(zhèn)靜劑,如地西泮（安定）、苯巴比妥、異丙嗪或氯丙嗪,必要時(shí)2～4小時(shí)后重復(fù)一次。

（1）赫氏反應(yīng)盡快使用鎮(zhèn)靜劑,并靜滴或靜注氫化可的松。

（2）肺出血型特別是肺彌漫性出血型患者應(yīng)及早加強(qiáng)鎮(zhèn)靜劑的使用,及早給予氫化可的松緩慢靜注。嚴(yán)重者氫化可的松每日用量可達(dá)l000～2000mg。根據(jù)病情給予強(qiáng)心藥毛花甙丙。

（3）黃疸出血型加強(qiáng)護(hù)肝、解毒、止血等治療,治療原則與方法同病毒性肝炎的治療。如有腎功能衰竭,按急性腎衰處理。4、后發(fā)癥治療

（1）后發(fā)熱反應(yīng)性腦膜炎,一般對(duì)癥治療,短期即可緩解。

（2）葡萄膜炎可用1%阿托品或l0%新福林滴眼擴(kuò)瞳,必要時(shí)可服用或注射腎上腺皮質(zhì)激素。

（3）閉塞性腦動(dòng)脈炎大劑量青霉素聯(lián)合腎上腺皮質(zhì)激素治療,輔以血管擴(kuò)張藥。

二、微生物學(xué)特性1、形態(tài)結(jié)構(gòu)問(wèn)號(hào)鉤端螺旋體的螺旋細(xì)密、規(guī)則，一端或兩端彎曲使菌體呈C、S型，故名。G-、但不易著色，

Fontana鍍銀染色法：棕褐色暗視野顯微鏡：運(yùn)動(dòng)活潑、折光性強(qiáng)的白色的鉤端螺旋體。

問(wèn)號(hào)狀鉤端螺旋體基本結(jié)構(gòu)：

外膜，內(nèi)鞭毛和原生質(zhì)圓柱體。兩根內(nèi)鞭毛纏繞在原生質(zhì)圓柱體表面呈螺旋狀，使其能活潑地沿長(zhǎng)軸旋轉(zhuǎn)向前運(yùn)動(dòng)。該菌革蘭染色陰性，不易著色。常用Fontana鍍銀染色法呈棕褐色。2、抗原構(gòu)造屬特異性抗原：糖蛋白或脂蛋白。

只存在于鉤端螺旋體屬中，故屬特異性抗原有助于鉤端螺旋體病的血清學(xué)診斷。群特異性抗原：菌體脂多糖復(fù)合物（菌體內(nèi)）型特異性抗原:

菌體表面，有表面抗原，多糖蛋白復(fù)合物。顯微鏡凝集試驗(yàn)（MAT）和凝集素吸收試驗(yàn)（AAT）可用于血清群和血清型分型。我國(guó)有19個(gè)血清群、161個(gè)血清型。3、基因組

問(wèn)號(hào)狀鉤端螺旋體基因組DNA己測(cè)序的有兩個(gè)血清型：黃疸出血群賴型56601株和黃疸出血群哥本哈根型FiocruzL1-130株，均有大小兩個(gè)環(huán)狀的染色體。4、培養(yǎng)特性需氧、營(yíng)養(yǎng)要求較高，常用Korthof（柯氏）（含10%兔血清）液體培基（致病性螺旋體中唯一可以人工培養(yǎng)的）28℃～30℃，pH7.2-7.6培養(yǎng)1～2周，液體培養(yǎng)基:半透明云霧狀混濁（液面1cm的部位最豐富）固體培養(yǎng)基:形成扁平、透明、不規(guī)則菌落。

問(wèn)號(hào)狀鉤端螺旋體不分解糖類和蛋白質(zhì)，能產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶，有的問(wèn)號(hào)狀鉤端螺旋體株可產(chǎn)生溶血素。5、抵抗力較細(xì)菌弱，但比其他致病性螺旋體強(qiáng)。

4℃14d仍生長(zhǎng)，耐冷不耐熱，濕土中生存半年以上，水中生存數(shù)周～數(shù)月。

0.2%甲酚皂、1％苯酚、1：2000升汞經(jīng)10～30min可殺滅。

60℃1min死亡。

對(duì)青霉素敏感。（一）標(biāo)本采集：可從臨床標(biāo)本、攜帶者和自然界的水中分離獲得，標(biāo)本有血、尿、CSF。（二）程序

標(biāo)本（血、尿、CSF等）

動(dòng)物接種鏡檢PCR分離培養(yǎng)（Korthof培基）心血培養(yǎng)

28℃

1-2周暗鍍直鑒定視銀接

野染免血清學(xué)試驗(yàn)（MAT、ELISA等）色

疫熒光

三、微生物學(xué)檢查

（三）方法

1、直接涂片鏡檢

直接顯微鏡檢查：暗視野、Fontana鍍銀染色、直接免疫熒光。

2、分離培養(yǎng)

Korthof培養(yǎng)基

(1)血：1周內(nèi)采血1-2ml培養(yǎng)，陽(yáng)性率70%～100%連續(xù)觀察30天未見(jiàn)菌生長(zhǎng)，方能報(bào)（-）。

(2)尿、CSF：2周～

5周（

3）鑒定：取混濁培養(yǎng)物經(jīng)離心沉渣用暗視野或鍍銀染色顯微鏡檢查，如有問(wèn)號(hào)狀鉤端螺旋體存在，則用已知診斷血清鑒定其血清群和血清型。

DNA雜交

用同位素、生物素、地高辛標(biāo)記鉤體特異DNA探針檢測(cè)尿中鉤體DNA。動(dòng)物接種是分離鉤體的一種敏感方法，尤其是有雜菌污染的標(biāo)本，通過(guò)動(dòng)物可獲得純株。黃疸出血型對(duì)豚鼠、金黃色地鼠最敏感

5、血清學(xué)試驗(yàn)

抗體檢測(cè)（1）顯微鏡凝集試驗(yàn)（microscopicagglutinationtest,MAT）當(dāng)待檢血清中有相應(yīng)抗體存在時(shí)，則鉤體被凝集成團(tuán)，形如蜘蛛樣；若血清中抗體效價(jià)較高時(shí)，鉤體可先被凝集而后溶解呈折光率高的團(tuán)塊或蝌蚪狀。

抗原：標(biāo)準(zhǔn)菌株（或當(dāng)?shù)亓餍兄辏?/p>

4～

7天培養(yǎng)物（活鉤體）方法：病人血清（56℃，30min滅活)

稀釋成1:50、1:100、1:200等。0.1ml血清+0.1ml活菌→28℃～30℃，2h→暗視野觀察。結(jié)果：以2+的最高血清稀釋度為血清效價(jià)，大于1:300有意義，或恢復(fù)期比早期增高4倍可確診本病。

抗體檢測(cè)

顯微鏡凝集試驗(yàn)

鉤端螺旋體凝集試驗(yàn)（暗視野）

陰性對(duì)照陽(yáng)性反應(yīng)（++）

（2）間接凝集試驗(yàn)將鉤體屬特異抗原吸附于載體顆粒上+病人血清（抗體）→凝集（載體顆粒凝集，故為間接）常用的有：間接血凝（綿羊紅細(xì)胞）試驗(yàn)，膠乳凝集（聚苯乙烯膠乳微小顆粒）及凝集抑制試驗(yàn)。

單份血清標(biāo)本活性炭凝集效價(jià)>1：8、膠乳凝集效價(jià)>1：2可判為陽(yáng)性，雙份血清標(biāo)本效價(jià)呈4倍以上增高則更有診斷價(jià)值。

凝集抑制試驗(yàn)原理

早期病人血清（尚無(wú)抗體）

+鉤體免疫血清

（血清中有抗原則結(jié)合消耗免疫血清的抗體）

+鉤體抗原致敏的膠乳懸液→

不凝集，為陽(yáng)性

6.動(dòng)物試驗(yàn)（3）TR/PatocⅠ特異性屬抗原玻片凝集試驗(yàn)

主要測(cè)IgM（屬特異性抗體），適于早期診斷和流調(diào)。

（4）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)被測(cè)血清OD值，為陰性對(duì)照血清的2倍，為陽(yáng)性。

適用于有雜菌污染的標(biāo)本。常用幼齡豚鼠或金地鼠。第二節(jié)密螺旋體屬

密螺旋體的螺旋細(xì)密、規(guī)則、兩端尖、數(shù)目較多，分為致病與非致病兩大類。對(duì)人致病的有：蒼白螺旋體：蒼白亞種梅毒

性病地方亞種地方性梅毒極細(xì)亞種雅司病非性病品他螺旋體：品他病

(一)臨床意義：1.致病物質(zhì)：

外膜蛋白：黏附作用表面粘多糖和唾液酸：形成莢膜樣物質(zhì)。透明質(zhì)酸酶免疫逃逸過(guò)敏反應(yīng)2.所致疾?。?/p>

梅毒

先天性梅毒：母體通過(guò)胎盤(pán)傳給胎兒

獲得性梅毒：性傳播、輸血傳播梅毒螺旋體

先天性梅毒（胎傳梅毒）

：多發(fā)生于妊娠4個(gè)月之后。引起胎兒的全身性感染，導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)或死胎。出生梅毒兒，呈現(xiàn)馬鞍鼻、鋸齒形牙、間質(zhì)性角膜炎、先天性耳聾等特殊體征。很難診斷，可用RPR半定量試驗(yàn)每月檢測(cè)1次，連續(xù)6個(gè)月，檢測(cè)反應(yīng)素效價(jià)，或用VDRL定量試驗(yàn)查抗體效價(jià)變化。如效價(jià)增高或穩(wěn)定在高水平，表明是先天性梅毒。如抗體是來(lái)自母體lgG，通常在2～3月內(nèi)消失。

先天性梅毒（胎傳梅毒）早期先天梅毒獲得性梅毒Ⅰ期（初期）梅毒：感染性極強(qiáng)，破壞性小感染后3周左右局部出現(xiàn)無(wú)痛性硬下疳，多見(jiàn)于外生殖器，一般4~8周后，常自愈。Ⅱ期梅毒：感染性強(qiáng)，破壞性小發(fā)生于硬下疳出現(xiàn)后2~8周。蒼白亞種螺旋體血癥，全身皮膚、粘膜常有梅毒疹，全身淋巴結(jié)腫大，有時(shí)亦累及骨、關(guān)節(jié)、眼及其他臟器。Ⅲ期(晚期)梅毒：感染性小，破壞性大發(fā)生于感染2年以后，亦可長(zhǎng)達(dá)10~15年的。病變可波及全身組織和器官?；緭p害為慢性肉芽腫，局部組織壞死。損害常進(jìn)展和消退交替出現(xiàn)。皮膚、肝、脾和骨骼常被累及。可危及生命。Ⅰ期（初期）梅毒：巨大下疳

Ⅱ期梅毒

II期梅毒：梅毒疹Ⅲ期(晚期)梅毒

晚期梅毒的潰瘍、壞死

III期（晚期）梅毒8~14個(gè)致密而規(guī)則的小螺旋，兩端尖直，原生質(zhì)圓柱體上緊繞著3~4根周漿鞭毛，故運(yùn)動(dòng)活潑，運(yùn)動(dòng)方式多樣。革蘭染色陰性，不易著染Fontana鍍銀染色法→染成棕褐色（二）生物學(xué)性狀1、形態(tài)與染色不能在無(wú)活細(xì)胞的人工培養(yǎng)基中生長(zhǎng)繁殖，且生長(zhǎng)慢。在家兔上皮細(xì)胞培養(yǎng)中能有限生長(zhǎng)，繁殖慢。3、基因組

環(huán)狀DNA，約為1138006bp，G+C平均為52.8mol％。2、培養(yǎng)4、抵抗力極弱對(duì)溫度和干燥特別敏感。對(duì)常用化學(xué)消毒劑亦敏感，1%~2%石炭酸內(nèi)數(shù)分鐘就死亡。對(duì)青霉素、四環(huán)素、紅霉素或砷劑均敏感。5、抗原成分表面抗原

—

刺激機(jī)體產(chǎn)生凝集抗體、制動(dòng)抗體或溶解抗體，但梅毒、雅司、地方性梅毒和品他病等4種密螺旋體抗原性相同。膜蛋白抗原

有22種，內(nèi)鞭毛蛋白有38種，其中外膜蛋白的47kD蛋白和內(nèi)鞭毛的37kD蛋白有很強(qiáng)的免疫原性。類屬抗原磷脂半抗原與宿主蛋白結(jié)合，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗磷脂自身抗體即反應(yīng)素，可與牛心肌類脂抗原發(fā)生反應(yīng)。假陽(yáng)性

—

與雅司、回歸熱、鼠咬熱、瘧疾、麻風(fēng)有交叉反應(yīng)

（三）微生物學(xué)檢驗(yàn)1、標(biāo)本：Ⅰ、Ⅱ期梅毒取下疳滲出液、梅毒疹滲出液或淋巴結(jié)穿刺液。先天性梅毒：臍血。2、檢驗(yàn)程序：3、直接鏡檢：主要適用于初期梅毒的篩查，患者下疳分泌物中有大量螺旋體。暗視野；Fantana鍍銀染色或免疫熒光。菌體柔軟，用于運(yùn)動(dòng)的類似鞭毛的軸絲位于細(xì)胞外鞘內(nèi)梅毒密螺旋體檢驗(yàn)程序

有病損無(wú)病損（下疳、皮疹、淋巴穿刺液）（血清、血漿）

暗視野、直接熒光陰性非密螺旋體抗原檢測(cè)抗體（篩選）

陽(yáng)性PCR反應(yīng)性無(wú)反應(yīng)性

陽(yáng)性滴定重復(fù)試驗(yàn)初報(bào)密螺旋體抗原試驗(yàn)（確定）反應(yīng)性，陽(yáng)性無(wú)反應(yīng)性，假陽(yáng)性非特異性：非密螺旋體抗原試驗(yàn)

抗原(正常牛心肌的心脂質(zhì))→血清中的反應(yīng)素(抗脂質(zhì)抗體)方法:VDRL和RPR試驗(yàn)。適用于大量初篩。特異性：密螺旋體抗原試驗(yàn)

抗原（Nichols株螺旋體）→螺旋體特異抗體

優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)，可用作梅毒證實(shí)試驗(yàn)常用方法：4、抗體檢測(cè)

非特異性非密螺旋體抗原試驗(yàn)：

1)性病研究所實(shí)驗(yàn)室(VDRL)玻片試驗(yàn)（VenerealDiseaseResearchLaboratory）

抗原：(0．03％心擬脂、0．21％卵磷脂、0．9％膽固醇，用無(wú)水乙醇配制)

待檢血清：經(jīng)56℃30min滅活，滴加于玻片的漆圈內(nèi)加等量抗原液，搖轉(zhuǎn)玻片5min充分混勻反應(yīng)后觀察結(jié)果。

結(jié)果：有大片絮狀凝聚物為(3+)，中等凝聚物為(2+)，細(xì)小凝聚物為(+)，液體混濁為(—)。2)快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn)(RPR,RapidPlasmaregioncirclecard)用活性炭顆粒吸附VDRL抗原。與反應(yīng)素結(jié)合形成黑色凝集塊，可肉眼觀察結(jié)果。取待檢血清加于環(huán)狀卡圓圈內(nèi)，加VDRL抗原致敏活性炭1滴，旋轉(zhuǎn)搖勻8min，觀察結(jié)果。在白色底板出現(xiàn)明顯黑色凝集顆粒為陽(yáng)性，試驗(yàn)結(jié)果用肉眼很容易判斷，不需顯微鏡，也易于推廣。特異性密螺旋體抗原試驗(yàn)：

由于梅毒螺旋體、雅司螺旋體等抗原性相似，所以用非密螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)不能區(qū)別這些密螺旋體及其所致疾病。用密螺旋體抗原試驗(yàn)檢測(cè)病人血清中特異性抗體做確證實(shí)驗(yàn)。

1)熒光密螺旋體抗體吸收試驗(yàn)(FTA-ABS)

先用非致病性螺旋體Reiter株去除病人血清非特異性抗原，提高特異性，稀釋成不同稀釋度，加于預(yù)先涂有梅毒螺旋體抗原的玻片上，置濕盒內(nèi)，37℃孵育30min，洗片后再用熒光素標(biāo)記的羊抗人丙球蛋白抗體，在熒光顯微鏡下觀察。

陽(yáng)性者可見(jiàn)發(fā)熒光的梅毒螺旋體。FTA-ABS試驗(yàn)具高度特異性和敏感性，在第一期梅毒的頭幾天就可測(cè)出特異性抗體。2)梅毒螺旋體熒光抗體雙染色試驗(yàn)

(FTA—ABS-DS)

用Nichol株梅毒螺旋體作抗原，加入待測(cè)血清，用四甲基異硫氰酸羅丹明結(jié)合的抗人球蛋白抗血清及異硫氰酸熒光素(FITC)結(jié)合的抗梅毒螺旋體球蛋白雙重染色，用間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)血清中的抗TPlgG抗體。FTA-ABS-DS法無(wú)論對(duì)早期梅毒或晚期梅毒都有很高的敏感性和特異性，且陽(yáng)性出現(xiàn)時(shí)間早。一期梅毒陽(yáng)性率達(dá)90％，晚期梅毒的陽(yáng)性率為95％。對(duì)確診病人的敏感性和特異性分別為91.7％和92.0％，但技術(shù)要求較高，且較費(fèi)時(shí)費(fèi)錢(qián)，因此多用于實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)。3)抗梅毒螺旋體抗體的微量血凝檢測(cè)

(MHA-TP)

用抗原致敏紅細(xì)胞作間接血凝試驗(yàn)是檢測(cè)抗體最簡(jiǎn)易的方法，所用抗原是用梅毒螺旋體(Nichols株)提取物去致敏經(jīng)醛化處理的綿羊紅細(xì)胞，病人的血清先與非致病性Reiter細(xì)胞作用。血清若含有抗體則與這些細(xì)胞反應(yīng)形成平鋪孔底的凝集；用非致敏紅細(xì)胞作對(duì)照，以排除非特異性凝集。4)梅毒螺旋體抗體明膠顆粒凝集試驗(yàn)

（TPPA）將梅毒螺旋體Nichols株的精制菌體成分包被在人工載體明膠顆粒上，產(chǎn)生粒子凝集反應(yīng)，出現(xiàn)明膠顆粒凝集者為陽(yáng)性。主要測(cè)血清和血漿中的梅毒螺旋體抗體及抗體效價(jià)。常用于篩選試驗(yàn)陽(yáng)性標(biāo)本的確診試驗(yàn)。5)ELISA用Nichols株為抗原，以超聲波擊碎。此法可用于各期梅毒診斷，靈敏度為96％，對(duì)感染血清靈敏度為95％。與熒光抗體雙吸收法(FTA-ABS-DS)比較，兩法符合率為96％。ELISA試劑具有價(jià)廉、保存時(shí)間久且穩(wěn)定(4個(gè)月)等優(yōu)點(diǎn)，是目前梅毒血清學(xué)診斷試驗(yàn)的首選方法。

6)免疫印跡試驗(yàn)

(immuno-blottingtest)

將梅毒螺旋體抗原用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)后，再將凝膠中的抗原經(jīng)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維薄膜上，將膜切成1．5mm寬小條。試驗(yàn)時(shí)加病人血清20μl(1:100稀釋)，置搖床上室溫過(guò)夜，次日用洗滌液洗3次后，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗血清(1：500稀釋)，室溫作用1小時(shí)后，加底物顯色5min后用蒸餾水沖洗，終止反應(yīng)。出現(xiàn)藍(lán)色區(qū)帶為陽(yáng)性。WHO推薦用VDRL、RPR法對(duì)血清進(jìn)行初篩試驗(yàn)；出現(xiàn)陽(yáng)性者用FTA-ABS、FTA-ABS-DS、MHA-TP、TPPA、ELISA和免疫印跡試驗(yàn)等方法做確認(rèn)試驗(yàn)。

第三節(jié)伯氏疏螺旋體(B.burgdorferi)伯氏疏螺旋體是萊姆?。↙yme）的病原體。1977年在美國(guó)康涅狄格州的萊姆鎮(zhèn)發(fā)現(xiàn)，1982年從硬蜱及患者體內(nèi)分離出伯氏疏螺旋休。1985年我國(guó)黑龍江省林區(qū)首次發(fā)現(xiàn)萊姆病，1988年從患者血中分離出病原體，全國(guó)27個(gè)省、自治區(qū)有此病存在。lyme病

回歸熱螺旋體

疏螺旋體屬螺旋體螺旋少而稀疏，且排列不規(guī)則，呈波狀，運(yùn)動(dòng)活潑。在自然界中存在宿主與媒介。疏螺旋體伯氏疏螺旋體流行性回歸熱地方性回歸熱

（一）臨床意義1.致病物質(zhì)粘附素，外膜蛋白OspA，LPS2.自然儲(chǔ)存宿主野生或家養(yǎng)的哺乳動(dòng)物，以嚙齒動(dòng)物的鼠、鹿、熊為主。我國(guó)的黑線姬鼠等。3.傳播媒介硬蜱（菌在蜱中腸內(nèi)生長(zhǎng)繁殖，叮咬宿主感染）4.Lyme病臨床表現(xiàn)

萊姆病臨床表現(xiàn)主要傳播媒介為硬蜱經(jīng)3~30d潛伏期，在叮咬部位可出現(xiàn)一個(gè)或數(shù)個(gè)慢性移行性紅斑(ECM)。晚期主要表現(xiàn)為慢性關(guān)節(jié)炎、慢性神經(jīng)系統(tǒng)或皮膚異常。為自然疫源性傳染病。游走性紅斑萊姆病的傳播媒介（二）微生物學(xué)特性

1．形態(tài)染色

疏螺旋體，兩端稍尖。運(yùn)動(dòng)活潑，有扭轉(zhuǎn)、翻滾、抖動(dòng)等方式。在培養(yǎng)基中，不規(guī)則地纏繞一起，呈卷圈狀。周漿鞭毛數(shù)2200根不等。與運(yùn)動(dòng)有關(guān)。Ｇ-，不易著色。Giemsa或Wright染色均好。Giemsa染色為淡紫色，鍍銀染色為棕褐色。伯氏疏螺旋體（電鏡×2000）

2．抗原成分

主要的有鞭毛蛋白(40kＤ)、外膜蛋白A(OspA)、B(OspB)和C(OspC)，60kD抗原。40kD鞭毛蛋白既是免疫原，也是致病原之一。3.基因組基因組DNA約1519132bp，由線性染色體與線性及環(huán)狀質(zhì)粒組成。4.培養(yǎng)特性營(yíng)養(yǎng)要求高，培養(yǎng)基需含有長(zhǎng)鏈飽和與不飽和脂肪酸、葡萄糖、氨基酸和牛血清蛋白及熱滅活兔血清等。微需氧，5％-10％C02促進(jìn)生長(zhǎng)。適宜溫度為35℃。生長(zhǎng)慢，1代需18h，需培養(yǎng)1～3周觀察到生長(zhǎng)情況。（三）微生物學(xué)檢驗(yàn)

1．標(biāo)本采集早期取病損皮膚組織、淋巴結(jié)抽出液、血液、關(guān)節(jié)滑膜液、腦脊液、尿液等。2.直接鏡檢用暗視野顯微鏡，觀察關(guān)節(jié)滑膜液、腦脊液、尿液等標(biāo)本中螺旋體的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)。因數(shù)量太少，故在實(shí)驗(yàn)室診斷中價(jià)值不大。用于蜱內(nèi)臟組織檢查,檢出率較高。3.核酸檢測(cè)用PCR技術(shù)檢查DNA，方法快速、敏感性高，用已知引物，以標(biāo)本中螺旋體質(zhì)粒DNA片段為模板，擴(kuò)增后形成309bp的DNA分子(是編碼OspA的基因片段)，經(jīng)瓊脂糖電泳證實(shí)。此DNA分子在所有伯氏疏螺旋體菌株中均可被檢出，而其他菌種則為陰性。4.分離培養(yǎng)標(biāo)本接種在BSK復(fù)合培養(yǎng)基中，33℃孵育。BSK培養(yǎng)基是含有牛血清白蛋白(BSA)和熱滅活兔血清等的液體培養(yǎng)基，通常從感染的脾中分離螺旋體較易獲得，而從損傷皮膚中分離較難。因分裂1代需12h以上，需培養(yǎng)2-3周可觀察生長(zhǎng)情況，長(zhǎng)者要12周之久，定期用暗視野顯微鏡觀察。5.抗體檢測(cè)（1）間接免疫熒光法(IFA)將螺旋體在BSK中培養(yǎng)5-7天，離心8200rpm30min收集螺旋體，稀釋至200個(gè)螺旋體／高倍鏡視野。取20μl懸液于玻片上，干燥后用丙酮固定5min。待檢血清以PBS倍比稀釋，于玻片加10～15μl稀釋血清，濕盒內(nèi)37℃孵育30min，洗后加熒光素標(biāo)記抗人IgG。IFA操作簡(jiǎn)便實(shí)用，但類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和其他螺旋體病可出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)。（2）ELISA

簡(jiǎn)單快速，為常用方法。主要檢測(cè)特異性IgM和IgG抗體，IgM主要靶抗原是表面抗原蛋白和鞭毛抗原。IgG主要靶抗原是外膜蛋白C和鞭毛蛋白。由于其有共同抗原和抗原的差異和變異，其結(jié)果應(yīng)結(jié)合臨床。（3）免疫印跡法

優(yōu)于ELISA，敏感性特異性均好。有助于排除ELISA出現(xiàn)的假陽(yáng)性結(jié)果。可直接檢測(cè)該菌的蛋白成分，也可檢測(cè)患者產(chǎn)生的抗體某種蛋白成分。6.動(dòng)物試驗(yàn)常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有小白鼠，金地鼠和兔等。以螺旋體懸液感染，可出現(xiàn)與人類相似的皮損癥狀，血培養(yǎng)亦陽(yáng)性，抗體效價(jià)顯著升高，可作為良好的動(dòng)物模型，常用新西蘭白兔。動(dòng)物試驗(yàn)雖是一種經(jīng)典的方法，但較繁瑣，有生物危害，現(xiàn)少用。二、回歸熱疏螺旋體病原體：回歸熱疏螺旋體，我國(guó)多見(jiàn)。1、流行性回歸熱（虱傳回歸熱）

傳播途徑：體虱帶菌，人被虱叮咬感染。

臨床癥狀：螺旋體反復(fù)入血，致發(fā)熱1周，退熱而體溫正常1周，高熱反復(fù)發(fā)作3～10次而稱之回歸熱。2、地方性回歸熱（蜱傳回歸熱）

病原體：杜通疏螺旋體等15種

傳播途徑：帶菌軟蜱，叮咬人感染

儲(chǔ)存宿主：嚙齒動(dòng)物

臨床癥狀：與虱傳型相似1.體內(nèi)正常菌群，寄生在口腔、齒齦及咽部2.常與寄居在口腔的梭形桿菌協(xié)同引起奮森咽峽炎、牙齦炎、潰瘍性口腔炎、口頰壞疽3.對(duì)青霉素、四環(huán)素等敏感三、奮森螺旋體第十九章立克次體

立克次體(Rickettsia)是一類專性活細(xì)胞內(nèi)寄生的、微小桿狀或球狀的G-原核細(xì)胞型微生物，是引起斑疹傷寒、恙蟲(chóng)病、埃立克體病等傳染病的病原體。由美國(guó)醫(yī)師H.T.Ricketts首次發(fā)現(xiàn)。一、分類：5、巴通體屬（Bartonella,包括羅沙利馬體）對(duì)人致病的立克次體包括五個(gè)屬：1、立克次體屬(Rickettsia)斑疹傷寒群斑點(diǎn)熱群2、柯克斯體屬(coxiella)3、東方體屬（Orientia,包括恙蟲(chóng)病群）4、埃立克體屬(Ehrlichia)

立克次體的共同特點(diǎn)是：

1.大小介于細(xì)菌與病毒之間；

2.有細(xì)胞壁，但形態(tài)多樣；

3.絕大多數(shù)為專性細(xì)胞內(nèi)寄生；

4.含有DNA和RNA兩種核酸，以二分裂方式繁殖；

5.大多是人獸共患病原體，引起人類發(fā)熱出疹性疾??；

6.以節(jié)肢動(dòng)物為傳播媒介或?yàn)閮?chǔ)存宿主；

7.對(duì)四環(huán)素、氯霉素等抗菌藥物敏感。

H.T.Ricketts1909年，首次發(fā)現(xiàn)斑疹傷寒的病原體，并因研究此病而犧牲，1916年人們以他的名字命名這類病原體作為紀(jì)念。

二、臨床意義脂多糖（LPS）

：引起發(fā)熱、休克等一系列反應(yīng)磷脂酶A：引起溶血，細(xì)胞損傷等。立克次體在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的大量增殖，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、浸潤(rùn)、壞死，血栓形成等，造成微循環(huán)障礙?？梢鹨园l(fā)熱、出疹為特征的疾病。臨床意義

立克次體是一種人獸共患病原體，對(duì)人類有致病性的已知為20余種。常以節(jié)肢動(dòng)物為媒介或儲(chǔ)存宿主，自然條件下在嗜血節(jié)肢動(dòng)物和哺乳類動(dòng)物間傳播循環(huán)，人類罹患主要是嗜血節(jié)肢動(dòng)物侵襲。病者排泄物塵埃或氣溶膠—

呼吸道感染。我國(guó)已證明存在斑疹傷寒、恙蟲(chóng)病、斑點(diǎn)熱、Q熱、埃立克次體病。

變異性

立克次體經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代后毒力減弱或變?yōu)闊o(wú)毒、抗原性無(wú)顯著差異，普氏立克次體變異株自然情況下難以生長(zhǎng)，可保持遺傳穩(wěn)定性，斑點(diǎn)熱群和恙蟲(chóng)病立克次體株，有很大的毒力和抗原性差異

生活力與抵抗力

對(duì)一般理化因素抵抗力不強(qiáng)：56℃30min死亡常用消毒劑（次氯酸鹽、來(lái)蘇）可短時(shí)間殺滅,媒介昆蟲(chóng)糞便中能抗干燥、抗寒、保持傳染性6個(gè)月,

Q熱立克次體抵抗力最強(qiáng)，恙蟲(chóng)病立克次體最脆弱,青霉素一般無(wú)作用，磺胺類不能抑制其繁殖,治療應(yīng)用廣譜抗生素

致病性立克次體及其所致疾病

普氏立克次體流行性斑疹傷寒人虱虱糞經(jīng)傷口感染莫氏立克次體地方性斑疹傷寒鼠蚤蚤糞經(jīng)傷口感染立氏立克次體落磯山斑點(diǎn)熱蜱蜱叮咬貝氏立克次體Q熱蜱接觸、呼吸道等恙蟲(chóng)病立克次體恙蟲(chóng)病恙螨恙螨幼蟲(chóng)叮咬查菲埃立克體單核細(xì)胞增多蜱蜱叮咬五日熱巴通體戰(zhàn)壕熱人虱虱糞經(jīng)傷口感染病原體

所致疾病

媒介

傳播方式致病性：1.普氏立克次體:⑴.傳染源:患者（唯一傳染源）⑵.傳播媒介:人虱⑶.所致疾病:流行性斑疹傷寒（虱傳斑疹傷寒）病人另一人人虱(抓破的傷口進(jìn)入體內(nèi))流行性斑疹傷寒隨糞便排出2.斑疹傷寒立克次體:⑴.傳染源:患鼠、患者

⑵.傳播媒介:鼠蚤、鼠虱

⑶.所致疾病:地方性斑疹傷寒（鼠型斑疹傷寒）

⑷.傳播途徑:蚤糞中立克次體破損皮膚體內(nèi)

口、鼻

眼結(jié)膜斑疹傷寒3.恙蟲(chóng)病立克次體:⑴.傳染源:帶病原體的野鼠和家鼠;

⑵.傳播媒介:恙螨;

⑶.所致疾病:恙蟲(chóng)病帶菌鼠人體局部紅色丘疹水皰,中央潰瘍

形成黑色焦痂

全身淋巴結(jié)腫大，肺、肝、脾、腦等損害恙螨幼蟲(chóng)叮咬恙蟲(chóng)病皮膚焦痂4.貝納柯克斯體（Ｑ熱柯克斯體）:⑴.傳染源:家畜（牛、羊等）;

⑵.傳播媒介:蜱

⑶.所致疾病:Ｑ熱（疑問(wèn)熱）⑷.傳播途徑:家畜污染環(huán)境人體糞便、尿直接接觸呼吸道、消化道

斑點(diǎn)熱病人全身性紅斑，出血甚至肢端壞死有的立克次氏體釀成嚴(yán)重疾病，如人類的流行性斑疹傷寒、羌蟲(chóng)熱、Q熱等，并常伴隨著災(zāi)害、戰(zhàn)爭(zhēng)和饑餓，曾長(zhǎng)期與人類的痛苦、災(zāi)難聯(lián)系在一起。貓抓病

大小介于細(xì)菌與病毒之間，能通過(guò)細(xì)菌過(guò)濾器；呈桿狀或球狀，G-

，Giemsa染色成紫紅色；

同時(shí)含DNA和RNA含兩種核酸，行二分裂繁殖；具有細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，細(xì)胞壁最外層有多糖組成的粘液；層，形成微莢膜，具粘附和抗吞噬作用；

專性細(xì)胞內(nèi)寄生，除五日熱巴通體外均不能人工培養(yǎng)生長(zhǎng)生長(zhǎng)緩慢，常接種雞胚（卵黃囊）培養(yǎng)；對(duì)四環(huán)素、強(qiáng)力霉素等抗生素敏感。

（一）基本特性三、微生物學(xué)檢查立克次體在胞內(nèi)大量生長(zhǎng)，胞核被壓向一側(cè)。不同立克次體的細(xì)胞內(nèi)位置：普氏立克次體：細(xì)胞質(zhì)分散存在；恙蟲(chóng)病東方體：細(xì)胞質(zhì)近核處成堆存在；斑點(diǎn)熱立克次體：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)和核內(nèi)生長(zhǎng)；Q熱柯克斯體：細(xì)胞質(zhì)空泡（吞噬溶酶體）內(nèi)生長(zhǎng)；五日熱巴通體：粘附于細(xì)胞外表面生長(zhǎng)。細(xì)胞中的立克次體人粒細(xì)胞埃立克次體Q熱立克次體在小鼠脾細(xì)胞空泡內(nèi)立克次體在田鼠陰道上皮細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)。（二）檢驗(yàn)程序

1.標(biāo)本采集

發(fā)熱期常用患者血液分離標(biāo)本

初期易于檢出，需作雙份血清試驗(yàn)活檢或尸檢材料

（1）病人血液

病程第一周內(nèi)，使用抗生素前采血接種動(dòng)物或培養(yǎng)病程一周后采血，應(yīng)分離血清

血清—

血清學(xué)試驗(yàn)

血凝塊

—

接種培養(yǎng)，避免抗體和抗生素的影響

（2）活（尸）檢材料

①組織標(biāo)本作印片直接檢查；

②制成10%～20%懸液，離心取上清接種

2、標(biāo)本直接檢出

（1）免疫熒光檢測(cè)

組織印片熒光檢查或常規(guī)染色鏡檢或組織病理切片檢查組織標(biāo)本為肺、脾、心瓣膜贅生物及肝、腎、皮疹活檢

(2)PCR

用立克次體編碼屬特異性基因序列設(shè)計(jì)引物，用PCR直接快速診斷并分型

3、分離與鑒定（1）立克次體分離

1）動(dòng)物接種

豚鼠或小鼠

豚鼠用雄性，觀察陰囊反應(yīng)

小鼠用于分離恙蟲(chóng)病立克次體、小蛛立克次體和腺熱埃立克體

（2）鑒定

1）免疫熒光法鑒定感染動(dòng)物臟器、雞胚卵黃囊、細(xì)胞培養(yǎng)物中的Ag2）已知抗原測(cè)恢復(fù)期動(dòng)物血清的Ab3）先鑒定群，進(jìn)一步作種的鑒定4）羅沙利馬體—熒光抗體、生化反應(yīng)、細(xì)胞脂肪酸和16srDNA序列等作判斷

2）人工培養(yǎng)基培養(yǎng)

羅沙利馬體感染病人的血液或病變組織接種于腦心浸液雙相瓊脂或血瓊脂，生長(zhǎng)慢，原始菌落呈菜花狀

觸酶、尿素酶等生化反應(yīng)均為陰性

3）細(xì)胞培養(yǎng)

▲腺熱埃立克體可在：人單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、鼠巨噬細(xì)胞P38801生長(zhǎng)

▲查菲埃立克體用犬巨噬細(xì)胞系DH82培養(yǎng)