復(fù)方中藥對(duì)肥胖模型小鼠的降脂健脾作用

復(fù)方中藥對(duì)肥胖模型小鼠的降脂健脾作用

中醫(yī)是中國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)。其基本理論可以概括為“整體觀念、辨證論治”。換句話說(shuō)，人體是一個(gè)有機(jī)的整體，通過(guò)區(qū)分和識(shí)別未知的“證據(jù)”，我們可以從根本上治療疾病。歷代醫(yī)家認(rèn)為,肥胖病與氣虛、痰、濕、淤有關(guān)。引起肥胖的原因有外感(濕邪)、食傷(過(guò)食肥甘)和正虛(脾虛)等因素。主要是脾胃受損、脾不散精,或脾腎不足,水道不利,變生膏脂痰濕,郁積體內(nèi)而成肥胖。因此,脾腎功能失調(diào)是肥胖病的病理基礎(chǔ)。本研究通過(guò)高脂飲食構(gòu)建小鼠營(yíng)養(yǎng)失衡的肥胖模型,選用可益氣健脾且安全無(wú)毒副作用的中藥材組成復(fù)方,研究該復(fù)方中藥的減肥、降脂及健脾作用,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。1材料和方法1.1試劑和儀器試驗(yàn)動(dòng)物:35日齡昆明種雌性小鼠50只,購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)。試劑:甘油三酯(TG,酶終點(diǎn)法)、總膽固醇(TCH,酶終點(diǎn)法)、高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C,PTA-Mg2+沉淀法)的測(cè)定試劑盒,均購(gòu)自溫州東甌津瑪生物科技有限公司;西布曲名,購(gòu)自陜西森弗生物技術(shù)有限公司;DMSO購(gòu)自Sigma公司;RNA提取試劑盒TRIZOL和DL2000DNAMarker購(gòu)自天根生化公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit和Taq酶購(gòu)自Fermentas;MIX購(gòu)自WOLSEN。其余試劑均為分析純。供試藥物:3g/mL的復(fù)方藥物浸膏(荷葉15%、海藻10%、黃芪20%、白術(shù)20%、茯苓20%、山楂15%)?；A(chǔ)飼料:面粉380g/kg,玉米粉200g/kg,麩皮160g/kg,豆粕150g/kg,魚(yú)粉40g/kg,骨粉30g/kg,酵母、食鹽、魚(yú)肝油和微量元素添加劑各10g/kg。高脂飼料:在普通日糧的基礎(chǔ)上添加200g/kg豬油即得高脂飼料。1.2小鼠的造模試驗(yàn)將50只小鼠隨機(jī)分成2組,第1組15只,飼喂基礎(chǔ)飼料,第2組35只,飼喂高脂飼料,連續(xù)飼養(yǎng)2周。2周后若高脂飼料喂養(yǎng)小鼠的體質(zhì)量超過(guò)基礎(chǔ)飼料組小鼠的20%,則可作為肥胖模型試驗(yàn)小鼠。從第1組中隨機(jī)選取10只小鼠,作為普通對(duì)照組(Ⅰ組);將第2組中造模成功的30只小鼠隨機(jī)分成3組,分別為模型對(duì)照組(Ⅱ組)、陽(yáng)性對(duì)照組(Ⅲ組)和藥物組(Ⅳ組)。Ⅰ、Ⅱ組小鼠以蒸餾水灌胃,用量0.2mL/(只·d);Ⅲ組小鼠以6.5mg/mL西布曲名溶液灌胃,0.2mL/(只·d);Ⅳ組小鼠以復(fù)方中藥浸膏灌胃,0.3mL/(只·d)。灌胃期間,Ⅰ組給予基礎(chǔ)飼料,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組給予等量的高脂飼料(飼料給予量以多數(shù)動(dòng)物吃完為原則)。試驗(yàn)期間小鼠自由飲水,飼養(yǎng)環(huán)境溫度為室溫。試驗(yàn)共進(jìn)行20d,第21天進(jìn)行小鼠抗疲勞試驗(yàn),結(jié)束后摘眼球采血并處死小鼠,取各組小鼠體脂及Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ組肝臟備用。1.3中藥療效試驗(yàn)1.3.1體質(zhì)量及脂肪系數(shù)給藥前,測(cè)量各組小鼠體質(zhì)量(始質(zhì)量)和體長(zhǎng),計(jì)算李氏指數(shù)以反映小鼠的肥胖程度;給藥期間,每天觀察小鼠的活動(dòng)情況、體毛色澤、飲食、飲水及糞便形狀等;20d后,測(cè)量各組小鼠體質(zhì)量(終質(zhì)量)和體長(zhǎng),計(jì)算李氏指數(shù)和體質(zhì)量增長(zhǎng)率。試驗(yàn)結(jié)束后處死小鼠,剖腹取體脂(腸系膜及腎周脂肪墊)并稱質(zhì)量,計(jì)算脂肪系數(shù)。李氏指數(shù)=[體質(zhì)量(g)×1000]1/3/體長(zhǎng)(cm);體質(zhì)量增長(zhǎng)率=(終質(zhì)量-始質(zhì)量)/始質(zhì)量;脂肪系數(shù)=體脂質(zhì)量/終質(zhì)量。1.3.2小鼠的水中采集小鼠抗疲勞試驗(yàn):給藥20d后,小鼠禁食16h,Ⅰ、Ⅱ組灌以蒸餾水,Ⅲ、Ⅳ組灌以相應(yīng)藥物,30min后,將小鼠放入水桶中(直徑30cm,深40cm,水深20cm,水溫28℃)。當(dāng)小鼠在水中游泳至過(guò)度疲勞不動(dòng)、鼻孔剛剛淹沒(méi)于水下時(shí)判作溺死,然后撈出。將小鼠入水至溺死所經(jīng)歷的時(shí)間作為抗疲勞試驗(yàn)指標(biāo)。1.3.3血清中tg、tch和hdl-c表達(dá)的測(cè)定小鼠給藥20d后,摘眼球采血。血液放入離心管靜置2h后,2000r/min離心10min,取上清液得血清,按照生化試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清中TG、TCH和HDL-C的濃度。1.4中藥對(duì)大鼠肝臟fas基因mrna的影響1.4.1總ra的提取采用Trizol試劑盒提取小鼠肝臟組織總RNA,用10g/L瓊脂糖凝膠檢測(cè)RNA的完整性。1.4.2pcr檢測(cè)n基因序列根據(jù)GenBank公布的小鼠FAS和β-actin基因序列,采用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)各基因的PCR引物。引物由北京華大基因公司合成,其具體序列、退火溫度、循環(huán)數(shù)及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1。1.4.3生物處理fer25U/μLTaKaRaTaq0.25μL,2.5mmol/LdNTPMixture2μL,10×PCRBuffer2.5μL,100ng/μLcDNA1μL,20μmol/LprimerF0.5μL,20μmol/LprimerR0.5μL,加滅菌水至25μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5min;退火30s(溫度依引物而定),72℃延伸30s,30個(gè)循環(huán);72℃10min,4℃冷卻。取PCR產(chǎn)物,進(jìn)行10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。1.5驗(yàn)數(shù)據(jù)及驗(yàn)算用Excel2009軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Xˉˉˉ±SD(Xˉ±SD)”表示。數(shù)據(jù)分析用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行,采用t檢驗(yàn),組間比較采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)顯著性。2結(jié)果與分析2.1各組小鼠體脂質(zhì)量的變化復(fù)方中藥對(duì)小鼠體質(zhì)量、李氏指數(shù)及體質(zhì)量增長(zhǎng)率的影響見(jiàn)表2。由表2可知,給藥后各組小鼠的體質(zhì)量都有所增加,其中模型對(duì)照組增加最為顯著(P<0.01);藥物組小鼠的體質(zhì)量雖高于普通對(duì)照組而低于模型對(duì)照組(P<0.01),且與陽(yáng)性對(duì)照組相差不大(P>0.05),但其體質(zhì)量增長(zhǎng)率卻最低,且與3個(gè)對(duì)照組相比差異顯著(P>0.05)。說(shuō)明在同等飼養(yǎng)條件下,供試復(fù)方中藥能夠降低小鼠體質(zhì)量的增加。由表2還可知,給藥前后,普通對(duì)照組小鼠的李氏指數(shù)增長(zhǎng)并不明顯,而Ⅱ～Ⅳ組小鼠的李氏指數(shù)相對(duì)于普通對(duì)照組均極顯著增加(P<0.01),其中模型對(duì)照組的李氏指數(shù)又顯著高于Ⅲ、Ⅳ組(P<0.05),表明肥胖小鼠模型構(gòu)建成功;藥物組小鼠李氏指數(shù)與陽(yáng)性對(duì)照組之間差異不顯著(P>0.05),說(shuō)明供試復(fù)方中藥能夠顯著降低小鼠的李氏指數(shù),且降低程度與西布曲名差異不大。由表3可知,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組小鼠體脂質(zhì)量顯著高于普通對(duì)照組(P<0.05),其中模型對(duì)照組體脂質(zhì)量顯著高于其他組(P<0.05);藥物組體脂質(zhì)量顯著低于模型對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)。各組小鼠腹部體脂沉積情況見(jiàn)圖1。由表3還可知,Ⅱ～Ⅳ組小鼠的脂肪系數(shù)均顯著高于普通對(duì)照組(P<0.05);模型對(duì)照組脂肪系數(shù)最高,且與陽(yáng)性對(duì)照組之間差異不顯著(P>0.05);而藥物組脂肪系數(shù)顯著低于模型對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)。說(shuō)明復(fù)方中藥能夠明顯減少小鼠體內(nèi)的脂肪沉積,從而降低脂肪系數(shù)。由以上結(jié)果可知,復(fù)方中藥可顯著降低肥胖小鼠的體質(zhì)量、體質(zhì)量增長(zhǎng)率、李氏指數(shù)和脂肪系數(shù),說(shuō)明該復(fù)方中藥有較好的減肥作用。2.2有利于健化作用的發(fā)揮與西醫(yī)不同,中醫(yī)認(rèn)為,脾有運(yùn)化水谷的功能,即脾既能消化飲食,又能統(tǒng)攝周身血液、調(diào)節(jié)血液循環(huán)。通常所說(shuō)脾有益氣作用的“氣”,就是代表人體機(jī)能的動(dòng)力,而這種動(dòng)力的產(chǎn)生,則有賴于脾發(fā)揮正常的運(yùn)化能力。脾與四肢、肌肉等有關(guān),若脾的運(yùn)化功能正常,則四肢活動(dòng)有力,體力充沛。表3顯示,藥物組小鼠的游泳時(shí)間顯著大于模型對(duì)照組(P<0.05),極顯著大于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.01),說(shuō)明復(fù)方中藥能夠顯著提高小鼠的抗疲勞性,具有益氣健脾作用。2.3對(duì)血脂指標(biāo)的影響表4顯示,模型對(duì)照組的TG、TCH和HDL-C水平均顯著高于普通對(duì)照組(P<0.05),說(shuō)明小鼠高血脂肥胖模型構(gòu)建成功。對(duì)于TG水平而言,陽(yáng)性對(duì)照組顯著低于Ⅰ、Ⅱ組(P<0.05),藥物組高于陽(yáng)性對(duì)照組而顯著低于Ⅰ、Ⅱ組(P<0.05);對(duì)于TCH水平而言,模型對(duì)照組顯著高于其他組(P<0.05),藥物組與陽(yáng)性對(duì)照組差異不顯著(P>0.05);對(duì)于HDL-C水平而言,Ⅲ、Ⅳ組顯著低于模型對(duì)照組(P<0.05),藥物組顯著低于陽(yáng)性對(duì)照組(P<0.05)。血清中甘油三酯及膽固醇含量是藥物減肥降脂功能常用的評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究降脂試驗(yàn)結(jié)果表明,給藥后,藥物組TG、TCH、HDL-C指標(biāo)較模型對(duì)照組均顯著降低,說(shuō)明供試復(fù)方中藥具有降血脂作用。2.4平均色深、質(zhì)構(gòu)。據(jù)表1,載胃法普通對(duì)照組小鼠平日精神狀態(tài)良好,毛色潤(rùn)澤、潔凈,取食飲水正常,糞便正常。模型對(duì)照組小鼠精神不佳、嗜睡、不愛(ài)運(yùn)動(dòng),毛色略發(fā)黃、油膩成簇,食欲逐漸減弱,糞便正常。陽(yáng)性對(duì)照組精神萎靡不振、嗜睡、不好動(dòng),毛色發(fā)黃、油膩成簇,食欲不振,糞便色淺。藥物組精神狀態(tài)良好,毛色潤(rùn)澤、潔凈整齊,取食飲水正常,糞便色深。由此可見(jiàn),在減肥效果差異不大的情況下,供試復(fù)方中藥的毒副作用明顯小于西布曲名。2.5不同基礎(chǔ)飼料對(duì)fasmrna表達(dá)的影響顏新春等研究表明,小鼠飼料中的脂肪酸對(duì)FAS基因的表達(dá)具有抑制作用,其原因是脂肪酸鏈中的雙鍵會(huì)影響脂肪酸合酶活性,而高脂飼料會(huì)導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞內(nèi)脂肪酸含量過(guò)高,從而使基因的表達(dá)量降低。圖2中,飼喂基礎(chǔ)飼料的普通對(duì)照組小鼠攝入體內(nèi)的脂肪酸含量相對(duì)較少,所以FASmRNA表達(dá)量高于模型對(duì)照組和藥物組;藥物組的FASmRNA表達(dá)量較模型對(duì)照組高,表明復(fù)方中藥能調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)過(guò)量攝入的脂肪酸,使其含量趨于降低,減少對(duì)FAS表達(dá)的抑制。3復(fù)方藥中中藥本研究顯示,供試復(fù)方中藥能夠顯著降低小鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)率、脂肪系數(shù)及血脂水平,提高小鼠的抗疲勞時(shí)間,還能降低高脂飲食小鼠機(jī)體內(nèi)脂肪酸的含量,說(shuō)明中藥對(duì)由飲食結(jié)構(gòu)變化引起的營(yíng)養(yǎng)代謝失衡有一定的調(diào)節(jié)作用。根據(jù)上述各結(jié)果推測(cè),供試復(fù)方中藥可能通過(guò)補(bǔ)“氣”增強(qiáng)了脾臟運(yùn)化水谷的能力,使攝入的脂肪酸代謝加快,從而減少了體內(nèi)的脂肪酸含量,達(dá)到減肥的目的。目前市場(chǎng)上治療肥胖的藥物主要有西布曲名、芬氟拉明、奧利司他等,這些藥物有一定的減肥效果,但副作用較強(qiáng),如西布曲名在使體質(zhì)量減小的同時(shí)會(huì)導(dǎo)致口渴、便秘、頭暈和失眠等,甚至?xí)绊懶难芟到y(tǒng)。國(guó)際上已制定了“不抑制食欲,不引起腹瀉,減輕體質(zhì)量而不降低體力”的減肥原則。本研究根據(jù)該原則進(jìn)行組方,采用的復(fù)方中藥中,荷葉所含主要有效成分為荷葉生物堿,為中醫(yī)常用的藥物,《本草綱目》記載“荷葉服之,令人瘦劣,單服可以消陽(yáng)水浮腫之氣”;海藻中富含海藻酸,能通過(guò)阻礙膽固醇的吸收和促進(jìn)肝臟內(nèi)膽固醇的消耗,降低人體內(nèi)的膽固醇含量;