輻照處理對(duì)中華絨螯蟹和三疣梭子蟹原肌球蛋白性質(zhì)的影響

輻照處理對(duì)中華絨螯蟹和三疣梭子蟹原肌球蛋白性質(zhì)的影響

根據(jù)流行病學(xué)研究，美國(guó)每年2.2.5%的人對(duì)食物不過(guò)敏，5%8%的兒童和嬰兒的發(fā)病率約為5%8%。2004年，食品公司恢復(fù)產(chǎn)品中過(guò)敏食品的比例達(dá)到47%。隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，食物過(guò)敏問(wèn)題越來(lái)越受到重視。近年來(lái)，關(guān)于蝦、螃蟹等食品來(lái)源性過(guò)敏食品的報(bào)道屢見(jiàn)不鮮。在聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織提出的8種原料類(lèi)型中，蝦、蟹等甲殼類(lèi)產(chǎn)品是最重要的類(lèi)。蝦、蟹是人們喜愛(ài)的食品，也是中國(guó)的重要出口產(chǎn)品。2006年，中國(guó)水產(chǎn)量超過(guò)100億元，其中出口69.7億美元，蝦、蟹等產(chǎn)品的出口量約為8.6億美元。這些是中國(guó)的主要出口產(chǎn)品。近年來(lái)，一些深度產(chǎn)品的份額逐漸增加，以蝦為原料的食品也在增加。蝦、蟹等水生產(chǎn)品的過(guò)敏問(wèn)題已成為下一個(gè)貿(mào)易技術(shù)壁壘。因此，對(duì)保持這些水生植物的食物安全和進(jìn)出口貿(mào)易具有積極意義。國(guó)內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn),已知食物主要過(guò)敏原多為分子量在10～60ku的蛋白質(zhì),它們對(duì)熱、酸、蛋白酶穩(wěn)定,其中蝦蟹類(lèi)過(guò)敏原主要為原肌球蛋白(Tropomyosin,TM),是分子量為36ku的酸性糖蛋白,等電點(diǎn)4.5左右.由于食物過(guò)敏原對(duì)蛋白酶、酸和熱的作用有一定的耐受性,常規(guī)的加工處理很難達(dá)到清除過(guò)敏原的要求.近年的研究發(fā)現(xiàn),輻照處理可以促進(jìn)生物大分子的降解、交聯(lián)和分子構(gòu)像的改變,降低蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,因而可望成為加工處理食物過(guò)敏原的新技術(shù).但是,國(guó)內(nèi)外關(guān)于輻照處理對(duì)蟹類(lèi)過(guò)敏原性質(zhì)影響的研究仍較少.作者分別采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)、免疫印跡(Western-Blotting)、免疫膠體金層析、液相色譜等技術(shù)和模擬胃液消化反應(yīng)分析輻照處理對(duì)蟹類(lèi)過(guò)敏原的性質(zhì)影響.1材料和方法1.1樣品的制備和分析方法鮮活中華絨鰲蟹(Eriocheirsinensis)購(gòu)于廈門(mén)菜市場(chǎng),去殼取肌肉立即使用或于-70℃冰箱保存;三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)由龍海奧瑞水產(chǎn)食品有限公司提供,去殼取肌肉立即使用或于-70℃冰箱保存;兔抗鋸緣青蟹(Scyllaserrata)TM抗體由本實(shí)驗(yàn)室人員制備;兔抗鋸緣青蟹TM抗體的免疫膠體金層析試紙條由本實(shí)驗(yàn)室人員制備;蟹類(lèi)過(guò)敏者血清及正常人血清由廈門(mén)市婦幼保健院和集美大學(xué)醫(yī)療中心提供;過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgE抗體購(gòu)自KPL公司;SDS所用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品液為Fermentas公司產(chǎn)品,Western-Bloting所用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品液從NewEnglandBioLab公司購(gòu)得;硝酸纖維素膜購(gòu)自Amersham公司;豬胃蛋白酶購(gòu)自Sigma公司;鈷60輻射裝置(GM-08-03-01,北京伽瑪高新科技有限公司生產(chǎn))由廈門(mén)萬(wàn)禾園輻照技術(shù)有限公司提供.1.2方法1.2.1核心穩(wěn)定劑fea本研究涉及的蟹類(lèi)過(guò)敏原即指TM,分離純化的依據(jù)是TM的特性,即鹽溶性蛋白、pI為4.5、熱穩(wěn)定性好等.TM的分離純化參照Liang的方法,略作修改,具體如下:將粗處理后的蟹類(lèi)肌肉分別用BufferA(50mmol/LKCl,2mmol/LNaHCO3)抽提,4℃離心,取沉淀重復(fù)操作4次;丙酮攪拌過(guò)濾;BufferB(20mmol/LTris-HCl,1mol/LKCl,10mmol/Lβ-巰基乙醇)抽提,4℃離心,取上清;調(diào)節(jié)pH至4.5,充分沉淀,并加入41%(NH4)2SO4,4℃離心;重復(fù)41%(NH4)2SO4鹽析后,加入60%(NH4)2SO4,溶液于4℃離心,取沉淀;BufferB溶解沉淀后,100℃水浴加熱15min,4℃離心;上清調(diào)節(jié)pH至4.5,充分沉淀;4℃離心;沉淀用Tris-HCl溶解即為部分純化的TM.1.2.2y,用量大,劑量部分純化的TM溶液及整蟹于室溫下輻照,輻照劑量分別為0、3、5、7、10kGy,劑量率為7Gy/min;輻照處理操作由廈門(mén)萬(wàn)禾園輻照技術(shù)有限公司完成.樣品處理后置于-20℃冰箱或立即置于冰盒中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室分析.1.2.3sds-gailon法是關(guān)于蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)的1.2.4網(wǎng)絡(luò)能量分析包括網(wǎng)絡(luò)能量分析1.2.5加待檢測(cè)的.在應(yīng)用兔抗鋸緣青蟹TM抗體的層析試紙條上滴加待檢測(cè)的樣品.如果檢測(cè)區(qū)出現(xiàn)紅色斑點(diǎn),則說(shuō)明結(jié)果呈陽(yáng)性,即樣品含有TM,如果檢測(cè)區(qū)未出現(xiàn)紅色斑點(diǎn),則說(shuō)明結(jié)果呈陰性,樣品不含TM.1.2.6相對(duì)分子質(zhì)量工作曲線(xiàn)的繪制采用GEHealthCareAKTAExplorer蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)和SuperdexPeptide10/300GL分析柱,分析條件分別為流速0.5mL/min、檢測(cè)波長(zhǎng)215nm、pH7.0PBS緩沖液,記錄出峰時(shí)間,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求出樣品的多肽相對(duì)分子質(zhì)量.所用標(biāo)準(zhǔn)品依次為細(xì)胞色素C、抑肽酶、維生素B12、(Gly)3和甘氨酸,它們的相對(duì)分子質(zhì)量分別為12384、6512、1855、189和75.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)分子質(zhì)量及其出峰時(shí)間,繪制標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)分子質(zhì)量工作曲線(xiàn).取適量待分析的輻照處理樣品超聲波脫氣25min,0.22μm膜過(guò)濾后上柱.1.2.7胃蛋白酶的gsf法在模擬胃液(Simulatedgastricfluid,SGF)消化試驗(yàn)中,參與消化反應(yīng)的酶是豬胃蛋白酶.反應(yīng)在500μL含2mg/mLNaCl的0.063mol/LHCl(pH1.2)體系中,37℃下振蕩進(jìn)行.消化反應(yīng)時(shí),1.24U的胃蛋白酶與底物的比例是1∶200(質(zhì)量比).在反應(yīng)0、1、2、5、10、15、30、60min時(shí)快速取出50μL樣品立即與15μL200mmol/LNa2CO3混合,終止反應(yīng),并置于冰上.其中0min是指將含有胃蛋白酶的SGF先與Na2CO3中和終止反應(yīng),再加入一定量的底物,并置于冰上;對(duì)照反應(yīng)不加胃蛋白酶,其余步驟相同.2結(jié)果2.1輻照處理對(duì)中華絨鰲蟹和梭子蟹的治療根據(jù)TM的鹽溶性、熱穩(wěn)定性、及pI4.5的性質(zhì),通過(guò)提取肌原纖維、制備丙酮粉、41%～60%(NH4)2SO4鹽析、調(diào)等電點(diǎn)、沸水加熱等方法,得到部分純化的目的蛋白TM,分子量分別約為36～38ku(圖1).無(wú)論是中華絨鰲蟹(圖1-A)還是梭子蟹(圖1-B)的部分純化TM經(jīng)輻照處理后的電泳結(jié)果一致顯示,與未經(jīng)輻照處理的TM相比,經(jīng)3kGy和5kGy劑量處理后TM無(wú)明顯變化;但隨著輻照劑量的不斷增加,在7kGy劑量處理后出現(xiàn)明顯降解,10kGy劑量處理后TM完全降解.同時(shí)設(shè)置的牛血清白蛋白(BSA)的輻照處理對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1-C所示,與未經(jīng)輻照處理BSA的結(jié)果相比,經(jīng)3kGy和5kGy輻照處理后的BSA無(wú)明顯變化,經(jīng)7kGy輻照后的BSA發(fā)生明顯降解,經(jīng)10kGy輻照處理后的BSA完全降解.這與部分純化TM的輻照處理結(jié)果相一致,說(shuō)明高劑量輻照處理不僅對(duì)過(guò)敏蛋白,對(duì)其它蛋白也具有降解作用.2.2輻照對(duì)中華絨鰲蟹和梭子蟹tm不同陽(yáng)性的影響采用蟹類(lèi)過(guò)敏者血清和正常人血清的Western-Blotting分析,進(jìn)一步確定不同劑量的輻照處理是否影響部分純化TM的過(guò)敏原性.結(jié)果如圖2所示,經(jīng)3～7kGy輻照處理后部分純化蟹類(lèi)TM的過(guò)敏原性無(wú)明顯變化,均與蟹類(lèi)過(guò)敏者血清出現(xiàn)明顯的雜交條帶,而經(jīng)10kGy輻照處理后的部分純化中華絨鰲蟹TM和梭子蟹TM均未出現(xiàn)雜交顯色條帶(泳道5);未經(jīng)輻照TM與正常人血清未出現(xiàn)雜交顯色條帶(未顯示結(jié)果).結(jié)果提示,10kGy輻照處理可明顯降低部分純化TM的過(guò)敏原性.2.3輻照處理整蟹肌原纖維蛋白將輻照處理后的整蟹分別提取其肌原纖維,進(jìn)行電泳分析.結(jié)果表明,與未經(jīng)輻照處理的整蟹相比,經(jīng)不同劑量輻照處理后的整蟹肌原纖維蛋白無(wú)明顯變化,其中過(guò)敏原TM也未見(jiàn)發(fā)生降解.經(jīng)10kGy輻照處理,對(duì)整蟹肌原纖維蛋白(含TM)也無(wú)明顯影響.2.4整蟹的典型特征整蟹經(jīng)輻照處理后其TM的Western-Blotting分析結(jié)果如圖3所示,整蟹經(jīng)3～10kGy輻照處理后其TM的過(guò)敏原性無(wú)明顯變化,它們均與蟹類(lèi)過(guò)敏者血清出現(xiàn)明顯的雜交條帶;而未經(jīng)輻照的整蟹與正常人血清未出現(xiàn)雜交顯色條帶(未顯示結(jié)果).結(jié)果提示,3～10kGy輻照處理對(duì)整蟹TM過(guò)敏原性無(wú)明顯影響.2.5紅色點(diǎn)檢出限在應(yīng)用兔抗鋸緣青蟹TM抗體的層析試紙條上滴加待檢測(cè)的部分純化TM樣品,在圖4-A中加入未經(jīng)輻照的部分純化中華絨鰲蟹TM,檢測(cè)區(qū)出現(xiàn)紅色斑點(diǎn);圖4-B中加入樣品為經(jīng)10kGy輻照后的部分純化中華絨鰲蟹TM,圖4-C中加入樣品為經(jīng)10kGy輻照后的部分純化梭子蟹TM,二者檢測(cè)區(qū)不顯色,說(shuō)明樣品中均不含TM.以上結(jié)果表明,經(jīng)10kGy輻照處理后的部分純化中華絨鰲蟹TM和梭子蟹TM的過(guò)敏原蛋白可能被完全降解,抗原性消失.2.6輻照處理前后生活質(zhì)量的變化采用SuperdexPeptide10/300GL分析柱,首先根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品(細(xì)胞色素C、抑肽酶、維生素B12、(Gly)3和甘氨酸)的相對(duì)分子質(zhì)量和出峰時(shí)間,繪制出標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)分子質(zhì)量工作曲線(xiàn),并得到標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程為y=-0.2275x+6.6679和相關(guān)系數(shù)R2=0.9923(式中y為相對(duì)分子質(zhì)量,x為出峰時(shí)間).圖5是部分純化中華絨鰲蟹TM溶液經(jīng)10kGy輻照處理后的多肽分子質(zhì)量分布圖譜,結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程可以得出輻照處理后部分純化TM中多肽的相對(duì)分子質(zhì)量及其所占比例(表1).由圖5和表1可知,未發(fā)現(xiàn)分子量約為36～38ku的目標(biāo)蛋白TM,表明經(jīng)10kGy輻照處理后中華絨鰲蟹TM被完全降解,并產(chǎn)生了一些分子量較小的蛋白、多肽和氨基酸,其中分子量約為360.6的小肽所占比例為27.19%,分子量約為182.5的小肽或氨基酸所占比例為35.40%,兩者合占62.59%.結(jié)果提示,10kGy劑量輻照處理可能破壞蟹類(lèi)TM肽鍵之間的作用力,從而產(chǎn)生大量的小肽和游離氨基酸.2.7其他蛋白的分解提取不同劑量輻照處理后整蟹肌原纖維蛋白,以豬胃蛋白酶為消化酶對(duì)其進(jìn)行模擬胃液消化反應(yīng).結(jié)果如圖6所示,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),中華絨鰲蟹肌原纖維中除TM以外的其他蛋白逐漸被分解;與肌原纖維中其他蛋白相比,TM則具有更高的消化穩(wěn)定性,直至60min時(shí)仍沒(méi)有被完全分解.但是,整只中華絨鰲蟹經(jīng)3～10kGy輻照處理后其肌原纖維蛋白(含TM)的消化穩(wěn)定性并沒(méi)有受到明顯的影響,即使是10kGy輻照處理后整蟹肌原纖維蛋白的消化降解規(guī)律與未輻照處理的基本相似(僅顯示部分試驗(yàn)結(jié)果).3輻照處理對(duì)中華絨鰲蟹及克氏原螯蟹tm蛋白凝膠的影響根據(jù)國(guó)內(nèi)外目前的研究報(bào)道,分子量為36～38ku的TM是蝦蟹類(lèi)主要過(guò)敏原.原肌球蛋白在甲殼類(lèi)水產(chǎn)品中是高度保守的,我們已分別克隆得到中華絨鰲蟹、鋸緣青蟹和三疣梭子蟹的TM基因序列,測(cè)序結(jié)果表明,3個(gè)基因的序列長(zhǎng)度均為855bp,編碼284個(gè)氨基酸殘基,三者氨基酸序列同源性為99.3%;而我們制備的動(dòng)物抗體中以兔抗鋸緣青蟹TM抗體的效價(jià)為最高,因此,采用交叉反應(yīng)性強(qiáng)且靈敏度高的兔抗鋸緣青蟹TM抗體和蟹類(lèi)過(guò)敏者血清進(jìn)行檢測(cè)分析,以中華絨鰲蟹和梭子蟹為原料,分別對(duì)部分純化TM蛋白溶液和整蟹進(jìn)行輻照處理,以明確輻照處理對(duì)蟹類(lèi)TM及過(guò)敏原性、酶解消化特性等方面的影響.輻照處理樣品的SDS電泳結(jié)果表明,3～5kGy劑量時(shí),部分純化蟹類(lèi)TM溶液并沒(méi)有明顯變化;7～10kGy劑量時(shí),部分純化TM溶液能被分解,甚至被完全降解;但無(wú)論是整只活的中華絨鰲蟹還是整只熟的梭子蟹經(jīng)3～10kGy輻照處理后,其TM均無(wú)明顯變化.Western-Blotting分析結(jié)果表明,部分純化蟹類(lèi)TM溶液經(jīng)3～7kGy輻照處理后的過(guò)敏原性無(wú)明顯變化,10kGy輻照處理后的TM過(guò)敏原性降低;但是3～10kGy輻照處理對(duì)整蟹TM的過(guò)敏原性均無(wú)明顯影響.部分純化蟹類(lèi)TM溶液經(jīng)10kGy輻照處理后的免疫膠體金層析檢測(cè)結(jié)果為陰性,進(jìn)一步表明TM抗原結(jié)合位點(diǎn)可能被破壞.模擬胃液消化反應(yīng)結(jié)果表明,蟹類(lèi)TM比肌原纖維其他蛋白具有更高的消化穩(wěn)定性,3～10kGy輻照處理對(duì)整蟹肌原纖維蛋白(含TM)的酶解消化特性均無(wú)明顯影響.總的來(lái)說(shuō),3～5kGy輻照處理對(duì)蟹類(lèi)TM并沒(méi)有明顯影響,10kGy輻照處理可明顯破壞部分純化TM及其抗原結(jié)合位點(diǎn);3～10kGy輻照處理對(duì)整蟹TM及其抗原結(jié)合位點(diǎn)無(wú)明顯影響.該結(jié)果與Li等報(bào)道的輻照處理結(jié)果具有相似性,Li等發(fā)現(xiàn)蝦蛋白溶液經(jīng)γ射線(xiàn)輻照后,TM一直存在,輻照劑量提高時(shí)其蛋白提取液濃度降低,過(guò)敏性也降低;而整蝦肌肉的過(guò)敏性隨著輻照劑量的提高表現(xiàn)為先上升后下降,達(dá)到10kGy劑量時(shí)會(huì)產(chǎn)生一條新的高分子量蛋白條帶,劑