酶工程課件 第一章

第一章緒論一、應(yīng)用舉例：1、纖維素酶：酒精燃料，紡織品拋光和剝色，廢紙脫墨。2、蛋白酶：皮革軟化，助消化劑，洗滌劑。3、青霉素?；福焊鞣N新型?一內(nèi)酰胺抗生素。二、酶和酶工程極其主要內(nèi)容：

1、酶：是一種生物催化劑，即：具有催化作用的蛋白質(zhì)或RNA。

2、酶工程：酶的研究、生產(chǎn)和應(yīng)用的技術(shù)。

3、酶工程的主要內(nèi)容：

優(yōu)良產(chǎn)酶菌種的育種；酶的分離純化；酶的分子修飾；酶反應(yīng)器；酶的應(yīng)用；酶的發(fā)酵生產(chǎn)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)酶與細(xì)胞固定化酶?jìng)鞲衅魅?、酶工程發(fā)展概況1、早期不知覺的利用階段：釀酒，制飴。2、認(rèn)識(shí)酶的階段：Pasteur:酵母中存在一種將葡萄糖轉(zhuǎn)化為酒精的物質(zhì)。Büchner:酶在胞外也具有催化活性。Sumner:分離脲酶結(jié)晶。Michaelis:提出米氏方程。Koshland“誘導(dǎo)契合”理論3、從生物組織或細(xì)胞中提取酶：胰酶：皮革軟化；木瓜蛋白酶：啤酒澄清4、酶的發(fā)酵生產(chǎn)：日本人首先用液體深層發(fā)酵法生產(chǎn)α-淀粉酶。5、酶固定化：日本人首先用固定化氨基酰化酶拆分DL-氨基酸；日本人首先用海藻酸鈣凝膠包埋酵母細(xì)胞生產(chǎn)啤酒；6、發(fā)展趨勢(shì)：*基因工程改造和表達(dá)酶*酶法在化學(xué)合成中的應(yīng)用*開發(fā)新酶及其新用途*酶的固定化四、酶學(xué)基本概念全酶酶的活性中心酶的別構(gòu)調(diào)節(jié)作用多酶體系同工酶酶原誘導(dǎo)酶五、酶學(xué)的一些新概念1.酶的活性中心:酶蛋白分子中一些基因在空間上相對(duì)集中形成一個(gè)直接參與底物識(shí)別結(jié)合和催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的區(qū)域。2.酶的別構(gòu)調(diào)節(jié):作用這種酶一般有多個(gè)亞基,除了活性中心外，還有可和別構(gòu)調(diào)節(jié)物結(jié)合的別構(gòu)部位,這兩個(gè)部位可在不同的亞基上或在同一亞基的不同部位中，當(dāng)調(diào)節(jié)物和別構(gòu)部位結(jié)合后可引起酶的構(gòu)象變化，導(dǎo)致活性中心對(duì)底物的結(jié)合和催化活性的改變，從而調(diào)節(jié)酶的活性.3.全酶:含有輔助因子的酶,當(dāng)酶輔助因子結(jié)合在一起時(shí)稱為全酶.4.寡聚酶:由多個(gè)相同或不相同的亞基組成的酶5.多酶體系:由幾種酶彼此以非共價(jià)鍵結(jié)合在一起形成的復(fù)合體,這些酶各催化不同的反應(yīng),它們組合起來催化一系列反應(yīng)的連續(xù)進(jìn)行。例如:脂肪酶合成酶復(fù)合體.6.誘導(dǎo)酶:當(dāng)細(xì)胞中加入特定誘導(dǎo)物后誘導(dǎo)產(chǎn)生的酶,它的含量在誘導(dǎo)物存在時(shí)顯著提高。誘導(dǎo)物常是其底物或其類似物.例如:大腸肝菌的半乳糖苷酶(乳糖為誘導(dǎo)物).相對(duì)地,把細(xì)胞中含量較穩(wěn)定，受外界影響較小的酶稱為結(jié)構(gòu)酶.7.核酶(Ribozyme):具有催化活性的RNA.由Cech于1982年首次發(fā)現(xiàn).1)四膜蟲rRNA的自我剪切作用(self-splicing),2)RNaseP中的RNA具有使tRNA5’一端成熟的作用,3)13srRNA具有肽基轉(zhuǎn)移酶(Peptidy1transferase)的作用.8.模擬酶:在基本骨架上連接酶活性中心的化學(xué)基因而形成的,這些基因可以結(jié)合底物并能催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物.例如:1)胰凝乳蛋白酶的模擬酶：將Asp的羧基，His的味唑基和Ser的羧基連接到?－環(huán)糊精上，發(fā)現(xiàn)其具有催化芳香酰類化合物的水解，但能耐８０℃和pH２～１３．２)谷胱甘肽過氧化物(GSHPx)的模擬酶:Glu-SelCys-Gly三肽也具有GSHPx的活性,即催化GSSG(還原型)+H2O2→H2O+GSSG(氧化型谷胱甘肽).Se(硒)和Cys相結(jié)合而形成SelCys.9.改造酶:主要是指利用蛋白質(zhì)工程的方法改變酶的一級(jí)結(jié)構(gòu),從而使其功能或特性發(fā)生改變。例如：1)將枯草桿菌蛋白酶的Gly166→Lys166后，水解谷氨酸相鄰肽鍵的效率較原來的酶高500倍2)葡萄球菌核酸酶:該酶水解RNA或DNA單鏈,但專一性很低.如果在其Cys116上接上22bp的oligonucleotide,這時(shí)該酶只能水解與該寡核苷酸序列互補(bǔ)的序列的相鄰核苷酸序列,從而提高了其專一性.(Gly-Phe)Gly-Phe10.抗體酶:用底物過渡態(tài)類似物作為半抗原免疫動(dòng)物，從而制備其抗體。這樣得到的抗體理論上應(yīng)能與底物結(jié)合并能發(fā)揮催化作用。例如:用三乙烯酰胺衍生物化學(xué)修飾的肽復(fù)合物(Gly-Phe)作為半抗原制備出能水解Gly-Phe肽鍵的抗體酶.該方法為今后獲得水解任何肽鍵的抗體酶奠定了基礎(chǔ),這對(duì)蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定具有重要意義.第二章酶的發(fā)酵生產(chǎn)一、有關(guān)說明：本章內(nèi)容在發(fā)酵工程中詳細(xì)介紹。二、從動(dòng)植物組織中提取酶：1、一些酶難以從微生物獲得或表達(dá)：胰酶，木瓜蛋白酶。2、缺點(diǎn)：工藝復(fù)雜、成本高、勞動(dòng)強(qiáng)度大、難以大規(guī)模生產(chǎn)、酶的品質(zhì)難以優(yōu)化。3、優(yōu)點(diǎn)：投資小，技術(shù)條件要求低。三、微生物發(fā)酵產(chǎn)酶1、產(chǎn)酶細(xì)胞的條件：產(chǎn)酶量高，培養(yǎng)基廉價(jià)，產(chǎn)酶性能穩(wěn)定不易退化，不易受噬菌體侵襲，酶易于分離純化（胞外酶），容易培養(yǎng)和管理，安全無害。2、發(fā)酵產(chǎn)酶的方法：固體培養(yǎng)發(fā)酵，液體深層發(fā)酵，固定化細(xì)胞發(fā)酵。3、提高酶產(chǎn)量的措施：添加誘導(dǎo)物（底物或其類似物：青霉素可誘導(dǎo)青霉素?；?，IPTG可以誘導(dǎo)?-半乳糖苷酶），控制阻遏物濃度葡萄糖阻遏?-半乳糖苷酶，組氨酸合成酶，添加表面活性劑（吐溫），添加產(chǎn)酶促進(jìn)劑。4、優(yōu)點(diǎn)：胞外酶易于分離純化，可以大規(guī)模地生產(chǎn)酶，可以用遺傳學(xué)方法或基因工程方法改造酶，成本一般較低。5、缺點(diǎn)：投資大，技術(shù)條件要求高。6、發(fā)展方向：基因工程改造、克隆和表達(dá)產(chǎn)酶。四、舉例：5‘—磷酸二酯酶的發(fā)酵生產(chǎn)：1、液體深層發(fā)酵流程：斜面培養(yǎng)：用8%麥芽汁—瓊脂培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)三天。種子培養(yǎng)：同上，接種于茄子瓶發(fā)酵培養(yǎng)：培養(yǎng)基組成為5%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.05%K2HPO4、0.04%MgSO4·7H2O、0.04%CaCl2·2HO、0.02%ZnSO4·7H2O,調(diào)pH6.028℃—30℃通風(fēng)培養(yǎng)。當(dāng)酶活力分泌達(dá)到最大值時(shí)，即可停止發(fā)酵。下游提?。悍殴?，濾去菌體，即得粗酶液，10℃以下保存?zhèn)溆谩?、固體培養(yǎng)的流程：斜面培養(yǎng)：將保存的桔青霉在察氏培養(yǎng)基上活化，28℃72小時(shí)左右成灰綠色孢子。接入克氏瓶培養(yǎng)。種子培養(yǎng)：麩皮100克和水150毫升攪勻，裝入容積為2升克氏瓶中，消毒，接種后28℃培養(yǎng)，72小時(shí)左右長(zhǎng)成灰綠色孢子。曲盤培養(yǎng)：一個(gè)克氏瓶接4—5個(gè)曲盤，接種量約為5%。每個(gè)曲盤（35×45平方厘米）內(nèi)裝500克麩皮。麩皮：水=1：1.2—1.3。曲房溫度為26—28℃

，需保持濕潤(rùn)。約3—4天后固曲培養(yǎng)到灰綠色時(shí)酶活力最強(qiáng)，應(yīng)立即出曲。如果時(shí)間延長(zhǎng)，菌變成深綠色時(shí)，酶活力下降，培養(yǎng)5天則變成褐綠色至褐色，活力幾乎全部消失。浸取酶液：加3—5倍水浸取，濾去菌體即得粗酶液。3、發(fā)酵曲線：

不管是液體培養(yǎng)或固體培養(yǎng)，，菌體分泌5‘—磷酸二酯酶的規(guī)律如圖所示。在培養(yǎng)的前期，僅有菌的生長(zhǎng)，并無酶的分泌，到菌的生長(zhǎng)達(dá)直線生長(zhǎng)期時(shí)，酶的分泌也呈直線增加。當(dāng)菌的生長(zhǎng)到禁止期時(shí)，酶的活力不再增加。時(shí)間過分延長(zhǎng)回因污染雜菌而導(dǎo)致酶活力的下降。采用固曲培養(yǎng)時(shí)，此現(xiàn)象尤為明顯。第三章酶的分離純化基本流程：1、細(xì)胞破碎（胞內(nèi)酶）2、抽提（extract)（胞內(nèi)酶）3、固液分離4、粗分離（蛋白質(zhì)的選擇性沉淀）5、純化6、濃縮、結(jié)晶或干燥7、產(chǎn)品化一、細(xì)胞破碎1、機(jī)械破碎法：*機(jī)械破碎法：設(shè)備簡(jiǎn)單，可大規(guī)模生產(chǎn)，但破碎不完全并對(duì)酶活有影響。*研磨法：研缽，球磨機(jī)和細(xì)菌磨，可大規(guī)模生產(chǎn)但效率低。*勻漿法：不適于大規(guī)模生產(chǎn)，效率不高。2、物理法：*溫度差破碎法：溫度突然變化使細(xì)胞破碎。細(xì)胞凍存。*壓力破碎法：設(shè)備復(fù)雜昂貴。*超聲波破碎法：10~25KHZ，產(chǎn)熱，處理樣品少。3、化學(xué)破碎法：有機(jī)溶劑或表面活性劑（Tween,triton),改變膜通透性。有機(jī)溶劑易燃易使酶失活，而后者常需用凝膠層拆除去。4、酶法：溶菌酶作用于細(xì)胞壁的?-1，4糖苷鍵。幾丁質(zhì)酶作用于霉菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)。缺點(diǎn)：價(jià)格貴，且不利后續(xù)分離純化。5、自溶法：在一定pH和溫度下，利用自身的酶使細(xì)胞裂解。在保溫過程中，目的酶會(huì)失活，而且會(huì)滋生其它微生物。二、酶的抽提1、酶的抽提是指在一定條件下，使酶充分溶解到溶劑中的過程。2、需要考慮的因素：*溫度：一般在0℃

~10℃

*pH：一般遠(yuǎn)離目的酶的等電點(diǎn)*抽提液的體積：一般為酶原料的3~5倍體積*添加保護(hù)劑：蛋白酶抑制劑，抗氧化劑或酶的穩(wěn)定劑*離子強(qiáng)度：有利于提高酶的溶解度三、固液分離1）離心方法：量小，產(chǎn)熱，價(jià)格貴。離心機(jī)的種類：管式離心機(jī)，碟片式離心機(jī)，臥式沉降離心機(jī)等。2）過濾：壓力過濾器、板框式過濾器、布袋過濾。過濾介質(zhì)有：濾紙、濾布、玻璃纖維、陶瓷濾板等。助濾劑有：硅藻土、活性炭、紙等。四、酶的粗分離

酶的粗分離就是指酶的選擇性沉淀，及：用一定方法把目的酶沉淀出來或把雜蛋白沉淀除去。1鹽析沉淀法1）什么是鹽溶現(xiàn)象？什么是鹽析？2）什么是分級(jí)鹽析法？3）為什么硫酸銨是鹽析最常用的鹽？在水中的溶解度大，溶解度受溫度影響小，價(jià)廉。4）鹽析沉淀法有何優(yōu)缺點(diǎn)？2、有機(jī)溶劑1）有機(jī)溶劑具有降低水的介電常數(shù)和破壞水化層的作用，從而使酶沉淀。2）常用有機(jī)溶劑：乙醇，丙酮，異丙醇等。3）優(yōu)點(diǎn)：分辨率高，所得的酶沉淀易于分離且不含無機(jī)鹽，易于后處理。4）缺點(diǎn)：有機(jī)溶劑易使酶變性，需低溫操作；易燃、易爆、有毒。3、等電點(diǎn)1）原理：在pH為酶的等電點(diǎn)時(shí)酶分子所帶的凈電荷為零，從而易聚集沉淀。2）缺點(diǎn)：在等電點(diǎn)時(shí)酶分子表面的水膜仍然存在，所以酶仍然有一定的溶解度而沉淀不完全。3）等電點(diǎn)法常用于和其它沉淀法聯(lián)合使用來沉淀酶和用于從粗酶中除去雜蛋白。4復(fù)合沉淀法1）復(fù)合沉淀法：某些物質(zhì)可以和酶形成復(fù)合物而沉淀下來，分離沉淀后又可以用適當(dāng)方法解離出來，從而達(dá)到分離酶的目的。2）常用沉淀劑：?jiǎn)螌?、聚丙烯酸?）例如：聚丙烯酸在pH3-5時(shí)和酶結(jié)合沉淀析出，pH6以上則二者分離，用2NH2SO4處理聚丙烯酸可重復(fù)使用。5選擇性熱變性五、純化1分子篩層析2離子交換層析3親和層析4電泳5吸附層析六、舉例:核酸酶的提取和精制1、粗酶液的制備若采用液體培養(yǎng)法，發(fā)酵液經(jīng)布袋壓濾除去菌體，即得金黃色透明粗酶液，在10℃下保存。若采用固體培養(yǎng)法，10倍的40-50℃的水保溫，浸泡和間歇攪拌1小時(shí)后，用布袋壓濾，即得粗酶液。在5‵-核苷酸的工業(yè)生產(chǎn)上，一般均直接使用粗酶液。2、酶粉制備預(yù)冷的酶液加入三倍體積預(yù)冷的工業(yè)酒精，使終濃度達(dá)70%以上。酶便呈絮狀沉淀大量析出，放置過夜。所有操作溫度要求在5℃左右。吸去上清液（回收酒精），離心得到酶糊，真空干燥或吹風(fēng)干燥，得到固體，研磨成粉，即為酶粉。一升發(fā)酵液通?？傻?-2克酶粉，活力回收在70%以上。酶粉十分穩(wěn)定，密封后在室溫下可保藏一年以上。具有體積小、易保藏的優(yōu)點(diǎn)。3、純酶制劑的制備

對(duì)此酶的性質(zhì)進(jìn)行研究或欲將此酶用于核酸的結(jié)構(gòu)研究，則需要制備較純的酶制劑。日本曾將此酶純化了1，500倍，得到一個(gè)超離心和圓盤凝膠電泳均一的純酶制劑。所有操作均在4℃進(jìn)行。（1）抽提：20千克固曲用60升自來水浸泡2小時(shí)，間歇攪拌，布袋壓濾，得到50升粗酶液。（2）第一次硫酸銨沉淀：加入34千克硫酸銨達(dá)0.9飽和度，放置過夜，離心，沉淀溶于1.5升去離子水中，透析過夜。（3）熱處理：在透析好的酶液（2.3升）中加1MZnCl2溶液上使終濃度為7×10﹣3M，用0.1NNaOH調(diào)pH至5.3，在70℃水浴中攪拌加熱至60℃，再移至63℃水浴中，在63℃不斷攪拌維持15分鐘，用冰浴冷至5℃，離心除去沉淀得2.5升酶液。經(jīng)這步處理可鈍化其他不需要的酶，例如水解RNA生成3‵-核苷酸的核酸酶、非專一的磷酸酯酶和5′-核苷酶。（4）第二次硫酸銨沉淀：加入750克硫酸銨，飽和度為0.4，放置過夜。離心除去沉淀。再加820克硫酸銨使上清液達(dá)0.8飽和度，放置過夜。離心收集沉淀，再溶于265毫升去離子水中，透析過夜。（5）丙酮沉淀：270毫升冷丙酮（-10℃）加入420毫升透析液中，攪拌30分鐘，放置2小時(shí)后，在-5℃離心10分鐘，將沉淀，溶于188毫升0.05M醋酸緩沖液（pH6.0）中，透析。（6）第一次葡聚糖凝膠G-100過濾：凝膠柱用上述緩沖液平衡后，樣品上柱，用同樣的緩沖液以20毫升/小時(shí)的流速過濾，收集比活力較高的溶液2升，加1，368克硫酸銨達(dá)0.9飽和度，放置2小時(shí)，離心，沉淀溶于25毫升0.05M醋酸緩沖液（pH6.0）中，并對(duì)緩沖液透析。（7）第一次DEAE纖維素柱層析：將酶活力峰收集得300毫升，加入205克硫酸銨，0.9為飽和度，放置2小時(shí)，離心，沉淀溶于20毫升0.05M醋酸緩沖液（pH6.0）中，并對(duì)緩沖液透析。（8）第二次DEAE-纖維素柱層析：所得的26毫升濃縮酶液用同樣方法在DEAE纖維素柱層析一次，酶集中在一個(gè)峰內(nèi)流出，收集后透析過夜，得12毫升。（9）第二次葡聚糖凝膠G-100過濾：酶活力集中在一個(gè)峰內(nèi)。收集后對(duì)流動(dòng)蒸餾水透析過夜。透析液放在盛有P2O5的干燥器里在4℃冷凍干燥。得到純的酶制劑。超離心檢查只有一個(gè)峰，電泳也是均一的，等電聚焦結(jié)果也是一個(gè)蛋白峰，等電點(diǎn)為4.5。問題：1、制酶粉時(shí)為何用有機(jī)溶劑沉淀而不用鹽析？2、得到酶沉淀后能否停下來室溫放置過夜再做（會(huì)變性和變壞嗎？）3、鑒定酶是否純的方法有哪些？4、硫酸銨飽和度是指什么？第六節(jié)酶制劑一、種類：狀態(tài)：液體、固體（粉末、凍干粉、結(jié)晶）二、級(jí)別：醫(yī)藥級(jí)：純無抗原食品級(jí)：無重金屬、細(xì)菌含量不超標(biāo)工業(yè)級(jí)：研究級(jí)：三、各種酶制劑的特點(diǎn)1、凍干粉、SOD穩(wěn)定價(jià)格貴、醫(yī)藥或保健品2、粉末：穩(wěn)定可大量生產(chǎn)，價(jià)格低，食品級(jí)3、液體：價(jià)格便宜，不穩(wěn)定，不易運(yùn)輸，工業(yè)級(jí)4、結(jié)晶：有規(guī)則的排列（研究級(jí)）。粉末無定型40%開始下降，60%過飽和，熵最低到結(jié)晶第七節(jié)酶活力測(cè)定1、酶活力單位（U）：在一定條件下，一般是指最適條件，1分鐘內(nèi)能使1umol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量為1U，國(guó)際單位IU2、酶濃度：?jiǎn)挝惑w積內(nèi)所含的酶活力單位（U/ml）3、比活力:單位重量中所含的酶活力單位(U/mg）4、酶活力的測(cè)定條件：1）V=V02）S>>E

（a）t達(dá)到一定時(shí)，p達(dá)最大（b）V0一定（可以認(rèn)為）V0=V問題:1.判斷反應(yīng)速度的標(biāo)準(zhǔn)是什么?2.多長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)為反應(yīng)速度?小于5%的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物.設(shè)時(shí)間梯度測(cè)定v并判斷v=v的平均值酶活力測(cè)定實(shí)例第五章酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)4.酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是研究各種酶反應(yīng)的影響,以及反應(yīng)物到產(chǎn)物之間可能進(jìn)行的歷程.1.當(dāng)t=0時(shí),[p]為0,隨著t增加,[p]增加,當(dāng)t達(dá)到一定值時(shí),[p]達(dá)到最大并不再隨t的增加而增加.2.v=d[p]/dt,反應(yīng)剛開始時(shí),初速度

,然后，v隨t的增加不斷減小,直到v=0.3.t[p]反應(yīng)進(jìn)程曲線E4.1單底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)4.1.1底物濃度對(duì)反應(yīng)速度的影響酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線隨[S]增加,V增加當(dāng)[S]達(dá)到等值,V達(dá)到最大值,此時(shí)為零級(jí)反應(yīng).當(dāng)[S]很小時(shí),為一級(jí)反應(yīng).[S]為中等值時(shí),介于一級(jí)和零級(jí)之間[s]4.1.2米氏方程

反應(yīng)剛開始時(shí)，P為0，故1k1k米氏方程反映的是但無普遍適用性，因?yàn)橛行┟复俜磻?yīng)速度很快，足以破壞米氏假設(shè)的平衡態(tài)米氏常數(shù)

也是當(dāng)時(shí)的單位和S相同當(dāng)4.1.51.（雙倒數(shù)）作圖缺點(diǎn)：不夠準(zhǔn)確；不利觀察E的作用機(jī)制2.Eadie-Hofstee作圖4.2多底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)單底物反應(yīng)只有異物酶;裂合酶可看成是單向單底物反應(yīng),水解酶,由于水的濃度可以看作是常數(shù)，也可認(rèn)為是單底物,而其它則是多底物酶促反應(yīng)4.2.1多底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分類1.在反應(yīng)中形成三元多合物(1)序列有序機(jī)制+B-pABPQEEEA(EAB－EPQ)EQ(2)序列隨機(jī)機(jī)制EABEPQ+B+A－P－Q(EAB－EPQ)ABPQBAQPEE2.不形成三元絡(luò)合物乒乓機(jī)制－P+B(EA－FP)F(FB－FQ)EEAPBQ4.2.3雙底物反應(yīng)恒態(tài)動(dòng)力學(xué)1.Alberty表達(dá)式5.酶的抑制作用生物體內(nèi)的酶促反應(yīng)速度是得到調(diào)節(jié)，也必須被調(diào)節(jié).調(diào)節(jié)酶的活性有兩個(gè)方面:抑制和激活.抑制劑就是指能降低酶催化反應(yīng)速度的物質(zhì)。通過研究酶的抑制作用有二個(gè)意義:部分揭示催化機(jī)理;研究體內(nèi)的代謝及其調(diào)控.5.1酶的可逆抑制作用可逆抑制劑和酶是以可逆反應(yīng)(外共價(jià))結(jié)合，可通過透析,超濾等物理手段使酶活性恢復(fù)竟?fàn)幮砸种?抑制劑往往和底物具有相似結(jié)構(gòu),和底物競(jìng)爭(zhēng)E上的同一結(jié)合部位,和酶結(jié)合使得底物不能和酶結(jié)合,導(dǎo)致酶無法發(fā)揮催化功能，在物不能轉(zhuǎn)受為產(chǎn)物反應(yīng)式1k+ⅠKiEI5.（雙倒數(shù)）作圖

[Ⅰ]=2[Ⅰ]=1[Ⅰ]=0特點(diǎn):底物和抑制往往具有相似結(jié)構(gòu),可以通過加大[S]而減小或清除抑制作用.舉例:并二酸對(duì)琥泊酸脫H酶的抑制磺胺類藥物對(duì)四氫葉酸合成酶的抑制5.1.2反競(jìng)爭(zhēng)性抑制1.定義:酶和底物結(jié)合,導(dǎo)致構(gòu)象改變,并顯出抑制劑結(jié)合的部位,或者Ⅰ結(jié)合到ES的S上Ⅰ和ES結(jié)合.2.反應(yīng)式:+ⅠKiESI4.雙倒數(shù)作圖

[Ⅰ]Vm

和Km都減小5.特點(diǎn):(1)不能通過增加[S]而消除抑制作用

(2)Vm

和Km都隨[I]增加而減小5.1.2非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用1.定義:I可和E或ES結(jié)合,EI或ESI都不能形成P即I和作底物結(jié)合部位結(jié)合2.反應(yīng)式:3.方程式:+ⅠKi+ⅠKi4.雙倒數(shù)作圖[Ⅰ]5.3酶的不可逆抑制作用5.3.1非專一性的不可逆抑制作用:

乙酸酐氨基,羥基,酚基5.3.2專一性的不可逆抑制作用:

它具有和底物類似的結(jié)構(gòu),并可以和相應(yīng)的酶專一性的結(jié)合,帶有一個(gè)活潑的化學(xué)作用,和酶的必需基因發(fā)生反應(yīng),對(duì)后者進(jìn)行化學(xué)修飾,從而抑制酶的活性.

親和標(biāo)記試劑例如:

o=胰凝乳蛋白酶的底物o=CH2胰凝乳蛋白酶的Ks型抑制劑第六章酶與細(xì)胞固定化一、固定化酶：把酶或菌體固定在固體載體上（使反應(yīng)局限在一定范圍）內(nèi)進(jìn)行。使酶在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行催化反應(yīng)。二、固定化細(xì)胞或原生質(zhì)體：將活的細(xì)胞或原生質(zhì)體固定到固相載體上，使其在一定的空間范圍進(jìn)行生命活動(dòng)，同時(shí)產(chǎn)生目的產(chǎn)物。三、游離酶的優(yōu)缺點(diǎn)（固定化酶）1、游離酶對(duì)溫度、PH等外界因素穩(wěn)定性差2、游離酶不能回收重復(fù)利用3、游離酶和產(chǎn)物混在一起給進(jìn)一步分離純化分離帶來困難4、難以進(jìn)行工業(yè)自動(dòng)化四、固定化酶和固定化細(xì)胞有何不同？第一節(jié)酶和細(xì)胞固定化方法一、吸附法1、利用非離子鍵和非共價(jià)鍵將酶或細(xì)胞固定到載體上2、吸附劑：活性炭、羥基磷、灰石、氧化鋁3、優(yōu)缺點(diǎn)：吸附不牢、易脫落、不硬氣引起酶活性改變二、包埋法：常用于細(xì)胞固定化（沒有化學(xué)鍵）1、將酶包埋在多孔載體中2、常用載體：瓊脂糖、聚丙烯酰胺、海藻酸鈉3、特點(diǎn)：條件溫和、不易使酶變性、反應(yīng)物和產(chǎn)物不易進(jìn)出、反應(yīng)效率不高三、結(jié)合法1、離子鍵結(jié)合法：適用于酶1）離子鍵使酶和載體結(jié)合2）載體：DEAE-纖維素、CM-纖維素3）結(jié)合不牢固、容易脫落、不引起酶性質(zhì)改變2、共價(jià)結(jié)合法1）通過化學(xué)反應(yīng)：使E以共價(jià)鍵和載體結(jié)合。E-NH-（CL）CH3-纖維素-N32）連接方法：疊氮法、烷化法、交聯(lián)法E-OHC-C-C-C-CHO-E-NC-C-C-C-CH-E第二節(jié)固定化酶的性質(zhì)影響固定化酶性質(zhì)的因素：結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，反應(yīng)微環(huán)境，底物的擴(kuò)散。1、穩(wěn)定性：空間結(jié)構(gòu)被部分定型、對(duì)墊、變性型蛋白酶等的穩(wěn)定性提高2、最適溫度：最適溫度和活化能變化不大3、最適PH：變化大1）載體O-EPH）溶液中的PH2）擴(kuò)散效應(yīng)4、底物特異性：可能會(huì)有些改變1）酶空間構(gòu)象被改變2）空間位阻O—E—S—越大，特意性改變?cè)酱?、Km值，一般也會(huì)改變

第三節(jié)固定化細(xì)胞和原生質(zhì)體1、概念2、固定化方法特點(diǎn)3、應(yīng)用1）微生物：酒精、氨基酸、有機(jī)酸、色素、輔酶2）廢水處理第四節(jié)固定化酶的表征1、活力單位u/mg（干固體）2、偶聯(lián)率=（加入酶活力數(shù)—上清中酶活力數(shù)）/酶活力數(shù)3、半衰期：在連續(xù)工作的情況下、固定化酶活力下降為原來最高活力的一半所需的時(shí)間第五節(jié)固定化酶和固定化細(xì)胞的應(yīng)用1、親和分離系統(tǒng)：例如：親和色譜對(duì)于藥用重組蛋白的純化十分有效2、藥物控釋載體：在基因治療中，如用紅細(xì)胞生成素（EPO）基因治療貧血，可將表達(dá)EPO的工程細(xì)胞株包埋于一小囊內(nèi)植入組織中，達(dá)到緩釋EPO的效果。3、生物傳感器：如Pharmacia公司BIA系統(tǒng)和目前市售的葡萄糖檢測(cè)儀，免疫分析檢測(cè)早孕等4、工業(yè)和環(huán)保：固定化葡萄糖異構(gòu)酶生產(chǎn)果葡糖漿，固定化細(xì)菌處理印染廢水實(shí)例：1、固定化酰化酶制備：18.5克DEAE葡聚糖凝膠A-25（OH型），懸浮于100毫升蒸餾水中，加入1670毫升米曲酰化酶溶液，攪拌5小時(shí)后放置過夜，過濾棄去濾液，沉淀與1000毫升蒸餾水?dāng)嚢?小時(shí)，過濾棄去濾液，如此反復(fù)用蒸餾水洗1-2次，依次用1000毫升醋酸鈉和1000毫升蒸餾水按上述方法洗一次，過濾棄去濾液，沉淀懸浮于500毫升蒸餾水中，冷凍干燥得到19.6克固定化米曲酰化酶干粉，簡(jiǎn)稱DSA絡(luò)合物。DSA絡(luò)合物（19.6克）在37℃

水解15700微克分子乙酰-L-甲硫氨酸/小時(shí)，在72℃水解41600微克分子乙酰-L-甲硫氨酸/小時(shí)，而72℃是DSA絡(luò)合物最適溫度。2、以固定化米曲?；赣谥虚g工廠生產(chǎn)L-色氨酸。酶柱連續(xù)工作50天（45℃

）酶活力損失25-30%，其簡(jiǎn)單工藝流程見圖16.6。圖16三醋酸纖維素包埋?；干a(chǎn)L-色氨酸流程D1---儲(chǔ)消旋?；被崛萜?R---酶反應(yīng)器;P---循環(huán);D2和D3---儲(chǔ)蓄器;E---蒸發(fā)器;S1和S2---離心器;D4---消旋化槽.問題:1.如何分離乙酰氨基酸和L-氨基酸?2.如何將乙酰-D-氨基酸消旋?

某些L-氨基酸在水中溶解度遠(yuǎn)低于其?；?D-氨基酸,將酶水解液濃縮則L-氨基酸結(jié)晶析出.過濾或離心后得到L-氨基酸結(jié)晶,再經(jīng)重結(jié)晶后可得旋光純的L-氨基酸.也可用離子交換樹脂將其分離.第七章酶反應(yīng)器1.什么是酶反應(yīng)器?2.酶反應(yīng)器有哪些類型?它們各有何特點(diǎn)?3.固定化對(duì)酶反應(yīng)器有何優(yōu)缺點(diǎn)