第2章新 基因工程及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用

三）質(zhì)粒

（plasmid）

質(zhì)粒是存在于細菌細胞質(zhì)中獨立于染色體而自主復(fù)制的共價、封閉、環(huán)狀雙鏈DNA分子（CovalentlyclosedCircularDNA,cccDNA）。

★不是細菌生長所必需的

★可賦予細菌抵御外界因素不利影響的能力

★分子量在1-200kb之間基因工程至少需要3種工具：限制性核酸內(nèi)切酶——“分子手術(shù)刀”DNA連接酶——“分子縫合針”基因進入受體細胞的運載體——“分子運輸車”主要從原核生物中分離純化出來1.1.1來源：1.1.2特點：1.1.3作用：1.1.4結(jié)果：具有專一性識別某種特定的核苷酸序列，使特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵切開形成兩種末端黏性末端平末端切開磷酸二酯鍵1.2DNA連接酶—“分子縫合針”1.2.1作用：恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵E.coliDNA連接酶：連接黏性末端T4DNA連接酶：連接黏性末端和平末端(效率較低)1.2.2種類：形成磷酸二酯鍵1.3基因進入受體細胞的運載體—“分子運輸車”1.3.1常用的運載體：質(zhì)粒、λ噬菌體衍生物、動植物病毒等質(zhì)粒：一種存在于細菌或細胞染色體外的能夠獨立復(fù)制的遺傳物質(zhì)。一般為雙鏈共價閉合環(huán)形DNA分子，長度為2-200kb。大腸桿菌及質(zhì)粒載體結(jié)構(gòu)模式圖1.3.2作為運載體所具備的條件：結(jié)構(gòu)小(即小載體（1－1.5kb）→不易損壞，在細菌里面拷貝數(shù)也多)對細胞無害能自我復(fù)制有標(biāo)記基因：有多個酶切位點等如四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等小結(jié)基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有專一性(識別序列)切開DNA分子的磷酸二酯鍵DNA連接酶連接磷酸二酯鍵種類E.coliDNA連接酶T4

DNA連接酶運載工具條件結(jié)構(gòu)小而穩(wěn)定能自我復(fù)制具多個限制酶切位點具標(biāo)記基因等質(zhì)粒、λ噬菌體衍生物、動植物病毒等基因工程的基本操作程序1、獲取目的基因2、構(gòu)建基因表達載體3、將目的基因?qū)胧荏w細胞4、目的基因的檢測與鑒定一、提取目的基因1、目的基因原核細胞基因結(jié)構(gòu)真核細胞基因結(jié)構(gòu)是所要研究或應(yīng)用的基因，也就是將要克隆或表達的基因或基因的一個片段。獲取目的基因是分子克隆中最重要的一步。2、獲取目的基因的常用方法（1）從基因文庫中獲取（2）利用PCR技術(shù)擴增（3）人工合成（通過DNA合成儀）基因文庫基因組文庫部分基因文庫如cDNA文庫包含了一種生物的全部基因的基因文庫叫做基因組文庫

將細胞所有mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA片段，克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中，構(gòu)建成含有不同cDNA片段的克隆載體混合物，此即cDNA文庫。基因組文庫與部分基因文庫的比較基因文庫的構(gòu)建將總DNA包含的基因組各片段分別克隆在質(zhì)?；蚴删w載體上，便構(gòu)成了該生物的基因文庫。cDNA合成過程

第一步，反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。基因組文庫將基因組DNA經(jīng)內(nèi)切酶消化后插入載體，得到含有不同插入片段載體，這種克隆載體混合物應(yīng)該含有不同基因組片段，此即基因文庫。cDNA文庫將細胞所有mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA片段，克隆到適當(dāng)?shù)妮d體中，構(gòu)建成含有不同cDNA片段的克隆載體混合物，此即cDNA文庫。各種組織或細胞的基因組或cDNA文庫都可以從公司購買。可用已知有限的信息合成特異性探針，采用分子雜交法從文庫中篩選感興趣的片段。構(gòu)建基因文庫的方法①鳥槍法(直接分離法)②反轉(zhuǎn)錄法提取某種生物的全部DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖幸欢ù笮〉腄NA片段將DNA片段與載體連接導(dǎo)入受體菌中儲存基因組文庫①鳥槍法(直接分離法)某種生物的mRNA單鏈互補DNA雙鏈cDNA片段導(dǎo)入受體菌中儲存與載體連接cDNA文庫逆轉(zhuǎn)錄②反轉(zhuǎn)錄法求異思維你能推測出由mRNA反轉(zhuǎn)錄形成cDNA的過程大致分為哪些步驟嗎？反轉(zhuǎn)錄酶既可以利用DNA又可以利用RNA作為模板合成與之互補的DNA鏈。像其他DNA聚合酶一樣，反轉(zhuǎn)錄酶也以5′→3′方向合成DNAcDNA合成過程是：第一步，反轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA單鏈，形成RNA-DNA雜交分子。第二步，核酸酶H使RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈降解，使之變成單鏈的DNA。第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子。如何從基因文庫中得到所目的基因？依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因的表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。①鳥槍法：供體細胞中的DNA許多DNA片段運載體限制酶與載體連接載入受體細胞產(chǎn)生特定性狀導(dǎo)入外源DNA擴增目的基因分離(直接分離法)(一)從基因文庫中獲取目的基因②反轉(zhuǎn)錄法：

以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。目的基因的mRNA雜交雙鏈(單鏈RNA/單鏈DNA)單鏈DNA反轉(zhuǎn)錄酶核酸酶HDNA聚合酶雙鏈DNA(目的基因)③根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：

根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學(xué)合成上述三種目的基因提取的方法有何優(yōu)缺點？優(yōu)點缺點鳥槍法反轉(zhuǎn)錄法根據(jù)已知氨基酸合成DNA法操作簡便廣泛使用工作量大，盲目，分離出來的有時并非一個基因?qū)Ｒ恍詮姴僮鬟^程麻煩，mRNA很不穩(wěn)定，要求的技術(shù)條件較高專一性最強僅限于合成核苷酸對較少的簡單基因思考:為什么要構(gòu)建基因文庫?直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎?尋根問底1.為什么要構(gòu)建基因文庫？直接從含有目的基因的生物體內(nèi)提取不行嗎？構(gòu)建基因文庫是獲取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通過PCR方式從含有該基因的生物的DNA中，直接獲得，也可以通過反轉(zhuǎn)錄，用PCR方式從mRNA中獲得，不一定要構(gòu)建基因文庫。但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想從一種生物體內(nèi)獲得許多基因，或者想知道這種生物與另一種生物之間有多少基因不同，或者想知道一種生物在個體發(fā)育的不同階段表達的基因有什么不同，或者想得到一種生物的全基因組序列，往往就需要構(gòu)建基因文庫。（2）利用PCR技術(shù)擴增目的基因PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一項生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。PCR技術(shù)原理：前提：條件：方式：結(jié)果：DNA復(fù)制一段已知目的基因的核苷酸序列以_____方式擴增，即____（n為擴增循環(huán)的次數(shù)）指數(shù)2n模板DNA；DNA引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶（Taq酶）等使目的基因的片段在短時間內(nèi)成快速地擴增

過程變性、退火、延伸三步曲變性：加熱至90～95℃氫鍵斷裂，雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA退火：冷卻至55～60℃引物與模板的單鏈DNA互補配對結(jié)合延伸：加熱至70～75℃以目的基因為模板，合成互補的新DNA鏈變性退火延伸（3）人工合成——根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA僅限于合成核苷酸對較少的簡單基因蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列推測推測目的基因化學(xué)合成（通過DNA合成儀）

根據(jù)已知蛋白質(zhì)的氨基酸序列，推測出相應(yīng)的信使RNA序列，然后按照堿基互補配對原則，推測出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列，再通過化學(xué)方法，以單核苷酸為原料合成目的基因。二、基因表達載體的構(gòu)建——核心（1）用一定的_________切割質(zhì)粒，使其出現(xiàn)一個切口，露出____________。（2）用___________切斷目的基因，使其產(chǎn)生_________________。（3）將切下的目的基因片段插入質(zhì)粒的______處，再加入適量___________，形成了一個重組DNA分子（重組質(zhì)粒）限制酶黏性末端同一種限制酶切口DNA連接酶相同的黏