衛(wèi)生化學(xué)-紫外可見(jiàn)分光光度法

1衛(wèi)生化學(xué)第四章紫外-可見(jiàn)分光光度法2紫外-可見(jiàn)分光光度法（ultraviolet-visiblespectrophotometry,UV-Vis）是光譜分析法中一種重要的、廣泛應(yīng)用的分析方法。光譜分析法（spectroscopicanalysis）：是指利用物質(zhì)與輻射能作用時(shí)所吸收或發(fā)射輻射的特征和強(qiáng)度而建立起來(lái)的定性、定量及結(jié)構(gòu)分析方法。3如原子吸收分光光度法如原子發(fā)射光譜法如紫外-可見(jiàn)、紅外如分子熒光分析法4紫外－可見(jiàn)分光光度法是根據(jù)物質(zhì)分子對(duì)紫外或可見(jiàn)光區(qū)電磁輻射的吸收特征和吸收程度建立起來(lái)的分析方法．紫外區(qū)波長(zhǎng)200～400nm

可見(jiàn)區(qū)波長(zhǎng)400～760nm特點(diǎn)靈敏度、準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)便快速、應(yīng)用廣泛5待測(cè)物質(zhì)6第一節(jié)概述

一、電磁輻射和電磁波譜光屬于電磁輻射，基本單位是光子，光子具有波粒二象性：波動(dòng)性7光的傳播速度：c－真空中光速2.99792458×108m/sn－折射率，真空中為1λ－波長(zhǎng)，單位：m,cm,mm,μm,nm,?（1?=10-10m）γ－頻率，單位：赫茲(周)Hz次/秒8光量子，具有能量：h－普朗克(Planck)常數(shù)6.626×10-34J·sγ－頻率E－光量子具有的能量單位：J(焦耳)，eV(電子伏特)1eV=1.602×10-19J微粒性9結(jié)論:一定波長(zhǎng)的光具有一定的能量，波長(zhǎng)越長(zhǎng)(頻率越低)，光量子的能量越低。單色光：具有相同能量(相同波長(zhǎng))的光。混合光：具有不同能量(不同波長(zhǎng))的光復(fù)合在一起.例如白光。波粒二象性高能輻射區(qū)γ射線能量最高，來(lái)源于核能級(jí)躍遷

χ射線來(lái)自內(nèi)層電子能級(jí)的躍遷光學(xué)光譜區(qū)紫外光來(lái)自原子和分子外層電子能級(jí)的躍遷可見(jiàn)光紅外光來(lái)自分子振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)的躍遷波譜區(qū)微波來(lái)自分子轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)及電子自旋能級(jí)躍遷無(wú)線電波來(lái)自原子核自旋能級(jí)的躍遷γ射線→X射線→紫外光→可見(jiàn)光→紅外光→微波→無(wú)線電波波長(zhǎng)長(zhǎng)電磁輻射按波長(zhǎng)順序排列稱(chēng)為電磁波譜。1112第二節(jié)基本原理1.紫外-可見(jiàn)吸收光譜的形成當(dāng)光通過(guò)氣態(tài)、液態(tài)或固態(tài)的物質(zhì)時(shí)，物質(zhì)分子選擇性吸收輻射，產(chǎn)生紫外-可見(jiàn)吸收光譜，又稱(chēng)為分子吸收光譜。

13物質(zhì)分子內(nèi)部三種運(yùn)動(dòng)狀態(tài)對(duì)應(yīng)三種能級(jí)：電子繞核運(yùn)動(dòng)（電子躍遷）→電子能級(jí)△E電原子在平衡位置上振動(dòng)→振動(dòng)能級(jí)△E振

分子繞軸轉(zhuǎn)動(dòng)（分子轉(zhuǎn)動(dòng)）→轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)△E轉(zhuǎn)

14電子基態(tài)電子激發(fā)態(tài)J3J2J1J3J2J1J3J2J1J3J2J1J3J2J1J3J2J115物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)的光線具有不同的吸收能力，物質(zhì)也只能選擇性地吸收那些能量相當(dāng)于該分子振動(dòng)能變化△Ev、轉(zhuǎn)動(dòng)能變化△Er以及電子運(yùn)動(dòng)能量變化△Ee的總和△E的輻射。由于各種物質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)的不同，分子的各種能級(jí)之間的間隔也互不相同，這樣就決定了物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)光線的選擇性吸收。有色物質(zhì)的不同顏色是由于吸收了不同波長(zhǎng)的光

（互補(bǔ)光）所致。172.分子吸收光譜及其特征將不同波長(zhǎng)的單色光依次通過(guò)一定的溶液，分別測(cè)出對(duì)各種波長(zhǎng)的光的吸收程度（用A表示）。以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光程度為縱坐標(biāo)作圖，所得的曲線稱(chēng)為吸收曲線（absorptioncurve）或吸收光譜(absorptionspectrum)。18吸收光譜特征：定性依據(jù)吸收峰→λmax

吸收谷→λmin

肩峰→λsh

末端吸收→飽和σ-σ躍遷產(chǎn)生A1920（一）有機(jī)化合物的電子躍遷類(lèi)型PxPyPzPxPyPzππ*σ*σn二、紫外－可見(jiàn)吸收光譜與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系

21按能量大?。害摇?>

n→σ*>

π→π*>

n→π*221.σ→σ*躍遷．飽和烴類(lèi)（單鍵，且都是σ鍵）吸收光能后多發(fā)生此類(lèi)躍遷，此躍遷所需能量大，（大約350kj/molσ鍵）一般吸收＜150nm的光，屬于遠(yuǎn)紫外區(qū)（真空紫外區(qū)）

23２．n→σ*躍遷

含有雜原子（O、N、S、X）的飽和烴衍生物，這些雜原子上的n電子向著σ*躍遷。吸收波長(zhǎng)在200nm左右．

24３．π→π*

此躍遷所需能量?。s200kj/mol鍵）．吸收波長(zhǎng)為200nm左右．具有碳—碳雙鍵（三鍵）的化合物會(huì)發(fā)生此類(lèi)躍遷．孤立的π→π*躍遷．

吸收波長(zhǎng)在160～190nm左右.如CH2=CH2

λmax=165nmε=104共軛雙鍵的π→π*

躍遷．

由于π與π鍵之間相互作用形成離域鍵，使π→π*躍遷所需能量減小，而且共軛鍵越長(zhǎng)所需能量越?。缍《〤H2=CH-CH=CH2λmax=217nm,ε=21000

25４．n→π*易發(fā)生在含有雜原子的不飽和基團(tuán)中，如C=O、C=S、—N=N—等化合物。這些雜原子都有未成鍵的孤電子對(duì)．此類(lèi)躍遷一般在近紫外區(qū)（200-400nm），但ε小，在10～100之間．261．電荷遷移躍遷（亦稱(chēng)內(nèi)ox—red過(guò)程）

所謂遷移躍遷是指用電磁輻射照射化合物時(shí)，電子從給予體向接受體相聯(lián)系的軌道上躍遷，過(guò)程見(jiàn)下：NCH3CH3－+hvhvCRO+_吸收譜帶較寬、吸收強(qiáng)度大、εmax≥104，是強(qiáng)吸收帶。電子接受體電子接受體電子給予體電子給予體電子接受體電子給予體（二）無(wú)機(jī)化合物的電子躍遷類(lèi)型272．配位場(chǎng)躍遷四、五周期中的過(guò)渡金屬元素分別有3d和4d軌道，鑭系錒系分別含有4f和5f軌道，在配體存在下過(guò)渡元素五個(gè)能量相等的d軌道和鑭、錒元素七個(gè)能量相等的f軌道分別分裂成幾組能量不等的d軌道及f軌道.當(dāng)它們吸收光能后，低能態(tài)的d電子或f電子可以分別躍遷到高能態(tài)的d軌道及f軌道上去。

一定要有配體的配位場(chǎng)作用.281．生色團(tuán)（發(fā)色團(tuán)）：能吸收紫外-可見(jiàn)光的基團(tuán)

有機(jī)化合物：具有不飽和鍵和未成對(duì)電子的基團(tuán)具n電子和π電子的基團(tuán)產(chǎn)生n→π*躍遷和π→π*躍遷躍遷E較低例：C＝C；C＝O；C＝N；—N＝N—

注：當(dāng)出現(xiàn)幾個(gè)發(fā)色團(tuán)共軛，則幾個(gè)發(fā)色團(tuán)所產(chǎn)生的吸收帶將消失，代之出現(xiàn)新的共軛吸收帶，其波長(zhǎng)將比單個(gè)發(fā)色團(tuán)的吸收波長(zhǎng)長(zhǎng)，強(qiáng)度也增強(qiáng)2．助色團(tuán)：本身無(wú)紫外吸收，但可以使生色團(tuán)吸收峰加強(qiáng)同時(shí)使吸收峰長(zhǎng)移的基團(tuán)有機(jī)物：連有雜原子的飽和基團(tuán)例：—OH，—OR，—NH—，—NR2—，—X5．紅移和藍(lán)移：由于化合物結(jié)構(gòu)變化（共軛、引入助色團(tuán)取代基）或采用不同溶劑后

吸收峰位置向長(zhǎng)波方向的移動(dòng)，叫紅移（長(zhǎng)移）

吸收峰位置向短波方向移動(dòng)，叫藍(lán)移（紫移，短移）32三、光的吸收定律

（一）Lambert-Beer定律一束單色光通過(guò)含吸光物質(zhì)的溶液時(shí)Ia入射光I0透過(guò)光It反射光IrI0＝Ia+It+Ir≈Ia+It

由上式可知,I0不變，若

Ia↑則It↓,反之亦然33我們把：

It／I0=

T稱(chēng)作透光率（度）

T×100=T%稱(chēng)作百分透光率（度）T越大，表示溶液對(duì)光的吸收越少T越小，表示溶液對(duì)光的吸收越多常用吸光度來(lái)表示物質(zhì)對(duì)光的吸收程度：34朗伯定律(1760年):

A=lg(I0/It)=k1b當(dāng)入射光的λ,吸光物質(zhì)的c一定時(shí),溶液的吸光度A與液層厚度b成正比。比爾定律(1852年):A=lg(I0/It)=k2c當(dāng)入射光的λ,液層厚度b一定時(shí),溶液的吸光度A與吸光物質(zhì)的c成正比。35朗伯-比爾定律式中：A：吸光度；

T:透射率；

b：液層厚度(光程長(zhǎng)度)，通常以cm為單位；

c：溶液的濃度，單位mol·L-1或g·L-1；

K：吸光系數(shù)意義:當(dāng)一束平行單色光通過(guò)均勻、非散射的溶液時(shí)，其吸光度與溶液中吸光質(zhì)點(diǎn)的濃度和吸收層厚度的乘積成正比.36值得注意的是：透過(guò)率T與c或b之間的關(guān)系是指數(shù)函數(shù)關(guān)系．吸光度A與c或b之間是簡(jiǎn)單的正比例關(guān)系．

1.00.50ACC100500T%T

＝10–A=10-Kbc

A＝-lgT

＝-lg(It/I0)=Kbc

37應(yīng)明確定律的三個(gè)應(yīng)用條件：1）稀溶液（C＜0.01mol/L)2）入射光為單色光3）均勻介質(zhì)，可以為固體、液體和氣體吸光度特性——加和性：A總=A1+A2+A3+A4…..38吸光系數(shù)（Absorptivity）

c---mol/Lε---摩爾吸光系數(shù)

L·mol–1·cm-1c--g/La---吸光系數(shù)

L·g–1·cm-1c--g/100mLE1%1cm---比吸光系數(shù)100mL·g–1·cm-1表示方法相互換算：39摩爾吸光系數(shù)ε

物理意義：當(dāng)一定波長(zhǎng)的單色光通過(guò)濃度為1mol/L，吸收池厚度為1cm的溶液時(shí)測(cè)得的吸光度。入射波長(zhǎng)不同，ε不同溶劑不同，ε不同物質(zhì)性質(zhì)不同，ε不同ε可作為定性依據(jù)在最大吸收波長(zhǎng)λmax處，常以εmax表示。41（二）偏離Beer定律的因素

偏離Beer定律的主要因素表現(xiàn)為以下兩個(gè)方面:1）光學(xué)因素2）與試樣溶液有關(guān)的因素1.00.50AC正偏離負(fù)偏離421.光學(xué)因素

1）非單色光的影響：非單色光指的是包含一定波長(zhǎng)范圍的有限寬度的譜帶，是以λ０（中心吸收波長(zhǎng)）為中心的一狹窄波長(zhǎng)范圍的復(fù)合光，對(duì)于帶寬為△λ（即圖中的Ｓ＝λ２－λ１）的單色光，測(cè)得的吸光度一般小于λ０處的真實(shí)吸光度值，從而產(chǎn)生負(fù)偏離。432）雜散光的影響：

雜散光是指從單色器分出的光不在入射光譜帶寬度范圍內(nèi)，與所選波長(zhǎng)相距較遠(yuǎn)。雜散光來(lái)源：儀器本身缺陷；光學(xué)元件污染造成?！羧魳悠凡晃誌S

則（I0+Is）／（I+Is）＜I0／I，使A↓

◆若樣品吸收IS，則反之，Ａ↑。442.溶液的物理及化學(xué)因素的影響１）溶液濃度的影響B(tài)eer定律的假定：所有的吸光質(zhì)點(diǎn)之間不發(fā)生相互作用；假定只有在稀溶液(C<10-2mol/L)時(shí)才基本符合。當(dāng)溶液濃度C>10-2mol/L時(shí)，吸光質(zhì)點(diǎn)間可能發(fā)生締合等相互作用，直接影響了對(duì)光的吸收。45２）體系（介質(zhì)）不均勻的影響根據(jù)定律的應(yīng)用條件之三（即均勻介質(zhì)），一般真溶液質(zhì)點(diǎn)小，對(duì)光的散射不特別厲害，但混濁液散射比較突出。膠體、乳膠、懸浮物、沉淀等非均相體系產(chǎn)生的光散射會(huì)引起對(duì)朗伯-比耳定律的偏離。解決的辦法：用空白做對(duì)比。46第三節(jié)紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)

一、分光光度計(jì)的主要部件碘鎢燈氘燈單色器參比池樣品池光電倍增管數(shù)據(jù)處理和儀器控制光源樣品池單色器檢測(cè)器數(shù)據(jù)處理儀器控制47白熾光源：如鎢絲燈、碘鎢燈(可見(jiàn)光區(qū)，320～2500nm)氣體放電光源：如氫弧燈（氫燈）、重氫燈（氘燈）(紫外區(qū)，180～375nm)、氙燈（紫外、可見(jiàn)光區(qū)均可用作光源）1.光源（輻射源）

4849２．單色器作用：將光源輻射的復(fù)合光按波的長(zhǎng)短順序色散為單色光包括狹縫、準(zhǔn)直鏡、色散元件1)狹縫入口狹縫：限制雜散光的進(jìn)入出口狹縫：讓色散后所需波長(zhǎng)的光通過(guò)。2）準(zhǔn)直鏡（透鏡或反射鏡）把來(lái)自入口狹縫的發(fā)散光變成平行光把來(lái)自色散元件的平行光聚焦于出口狹縫。503）色散元件常用的色散元件有三角棱鏡和光柵棱鏡：依據(jù)不同波長(zhǎng)光通過(guò)棱鏡時(shí)折射率不同51光柵在鍍鋁的玻璃表面刻有數(shù)量很大的等寬度等間距條痕(600，1200，2400條/mm)，利用光通過(guò)光柵時(shí)發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光。優(yōu)點(diǎn)：波長(zhǎng)范圍寬,色散均勻,分辨性能好,使用方便523．吸收池又名:比色皿，用于盛待測(cè)及參比溶液玻璃——能吸收UV光，僅適用于可見(jiàn)光區(qū)石英——不能吸收紫外光，適用于紫外和可見(jiàn)光區(qū)要求：匹配性（對(duì)光的吸收和反射應(yīng)一致）534．檢測(cè)器作用：是檢測(cè)通過(guò)溶液后的透過(guò)光強(qiáng)度

（光信號(hào)，并把光信號(hào)轉(zhuǎn)變成電信號(hào)）１）光電管銻銫作陰極：紫敏（200～625nm)銀／氧化銀：紅敏（625～1000nm)

90VDC直流放大陰極R-+光束e陽(yáng)極絲（Ni）抽真空54２）光電倍增管（photomultipliertube,PMT）石英套光束柵極，Grill陽(yáng)極屏蔽光電倍增管的放大倍數(shù)，主要取決于電極間的電壓。55二、分光光度計(jì)的類(lèi)型56１．單波長(zhǎng)單光束分光光度計(jì)57特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉使用時(shí)來(lái)回拉動(dòng)吸收池→移動(dòng)誤差比色池配對(duì)受光源、檢測(cè)器的波動(dòng)影響不能自動(dòng)記錄吸收光譜。582．單波長(zhǎng)雙光束分光光度計(jì)5960特點(diǎn)：不用拉動(dòng)吸收池，可以減小移動(dòng)誤差比切光器的頻率慢的光源、檢測(cè)器的波動(dòng)不影響可以自動(dòng)掃描吸收光譜61３．雙波長(zhǎng)分光光度計(jì)62特點(diǎn)：利用吸光度差值定量消除干擾和吸收池不匹配引起的誤差比切光器的頻率慢的光源、檢測(cè)器的波動(dòng)不影響63三種分光光度計(jì)的區(qū)別第四節(jié)分析條件的選擇一、溶劑選擇1.考慮溶劑的截止波長(zhǎng)截止波長(zhǎng)：用1cm光徑的吸收池裝溶劑，用空氣為參比，改變照射波長(zhǎng)，當(dāng)吸光度A＝l時(shí)，此時(shí)的波長(zhǎng)稱(chēng)為該溶劑的截止波長(zhǎng)。在選擇測(cè)量波長(zhǎng)時(shí)注意：溶劑必須能讓所選擇的光透過(guò)，即所選波長(zhǎng)不能小于溶劑的最低使用波長(zhǎng)（截止波長(zhǎng)）。652.考慮溶劑的極性溶劑的極性對(duì)物質(zhì)的吸收峰位置的影響不同當(dāng)極性增加時(shí)，π→π*的吸收峰發(fā)生長(zhǎng)移（紅移）n→π*的吸收峰發(fā)生短移（藍(lán)移、紫移）△

En→π*

△

Eπ→π*

△

En→π*

△

Eπ→π*

無(wú)溶劑化作用有溶劑化作用ππ*nππ*n66

二、顯色反應(yīng)條件的選擇