質(zhì)粒DNA的分離提取與瓊脂糖凝膠電泳

分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)名稱：質(zhì)粒DNA的分離提取與瓊脂糖

凝膠電泳

班級(jí)：生工XX

姓名：XXX學(xué)號(hào)：XXXXXXXXX質(zhì)粒DNA的分離提取與瓊脂糖凝膠電泳1引言質(zhì)粒(plasmid)是存在于細(xì)菌染色體外的一個(gè)或多個(gè)能獨(dú)立復(fù)制并穩(wěn)定遺傳的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子，分子量一般在0.2?10kb范圍內(nèi)⑴。質(zhì)粒由于其特殊的性質(zhì)，已廣泛地用作基因工程中的DNA分子無(wú)性繁殖的運(yùn)載體，同時(shí)它也是研究DNA結(jié)構(gòu)與功能的較好模型。我們將通過(guò)本次實(shí)驗(yàn)了解質(zhì)粒的特性及其在分子生物學(xué)研究中的作用，并掌握質(zhì)粒DNA分離純化的原理，學(xué)習(xí)堿裂解法分離質(zhì)粒DNA和瓊脂糖凝膠電泳分離的方法，同時(shí)熟練掌握移液器及離心機(jī)的使用。2材料和方法2.1實(shí)驗(yàn)原理質(zhì)粒DNA分離純化原理質(zhì)粒具有復(fù)制和控制機(jī)構(gòu)，能夠在細(xì)胞質(zhì)中獨(dú)立自主地進(jìn)行自身復(fù)制，并使子代細(xì)胞保持它們恒定的拷貝數(shù)。從細(xì)胞生存來(lái)看，沒(méi)有質(zhì)粒存在，基本上不妨礙細(xì)胞的存活，因此質(zhì)粒是寄生性的復(fù)制子。根據(jù)質(zhì)粒的這種特性，通常采用DNA體外重組技術(shù)和微生物轉(zhuǎn)化等基因工程的技術(shù)和方法，使重組到質(zhì)粒的某種基因(如干擾素基因)帶進(jìn)受體細(xì)胞(如具有一定特性的大腸桿菌細(xì)胞等)表達(dá)它的遺傳性質(zhì)，改變或修飾寄主細(xì)胞原有的代謝產(chǎn)物，或產(chǎn)生新的物質(zhì)(如干擾素)。pMD18-TVector是一種高效克隆PCR產(chǎn)物(TACloning)的專(zhuān)用載體。這種載體是由pUC18載體改建而成，在pUC18載體的多克隆位點(diǎn)處的XbaI和SalI識(shí)別位點(diǎn)之間插入了EcoRV識(shí)別位點(diǎn)，用EcoRV進(jìn)行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的3'端添加“T”而成。因大部分耐熱性DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)都有在PCR產(chǎn)物的3'末端添加一個(gè)“A”的特性，所以使用這兩種制品可以大大提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率［2］。所有分離質(zhì)粒DNA的方法都包括3個(gè)基本步驟：培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分離和純化質(zhì)粒DNA。目前應(yīng)用于質(zhì)體DNA的純化或抽取的方法眾多，例如堿溶裂法(alkalinelysis)、熱裂解法(boilingmethod)、氯化銫(CsCl)純化法，及市售柱層析套管法等。最常用的堿裂解法具效率高、價(jià)廉、簡(jiǎn)單易學(xué)等優(yōu)點(diǎn)。其原理是利用堿處理質(zhì)粒DNA及染色體DNA，使兩者雙股打開(kāi)呈單股狀態(tài)，再加酸中和，使單股回復(fù)為雙股DNA，同時(shí)在急速中和反應(yīng)中，染色體DNA因分子過(guò)于龐大以致于堿基匆忙配對(duì)，形成雜亂無(wú)序的巨大分子，對(duì)水的相對(duì)溶解度低而易被沉淀下來(lái)。相反，質(zhì)粒DNA因分子小，兩單股DNA恢復(fù)原堿基配對(duì)快而易溶于水中，所以只要經(jīng)過(guò)離心，即可將染色體DNA與質(zhì)體DNA分離。本實(shí)驗(yàn)是以堿裂解法(alkalinelysis)的方法進(jìn)行，其原理是將大腸桿菌以NaOH及SDS分解，并使蛋白質(zhì)及DNA變性，然后以酸中和。小分子質(zhì)粒DNA在中和后可恢復(fù)原分的大腸桿菌染色體DNA則無(wú)法完全復(fù)原而與SDSD-K+所含復(fù)合物一起沉淀下來(lái)，可離心去除，上清液所含質(zhì)粒則可以乙醇(ethanol)或異丙醇(isopropanol)將其沉淀下來(lái)。瓊脂糖凝膠電泳原理瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。其分析原理與其他支持物電泳的最主要區(qū)別是：它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。瓊脂糖凝膠具有網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，物質(zhì)分子通過(guò)時(shí)會(huì)受到阻力，大分子物質(zhì)在涌動(dòng)時(shí)受到的阻力大，因此在凝膠電泳中，帶電顆粒的分離不僅取決于凈電荷的性質(zhì)和數(shù)量，而且還取決于分子大小，這就大大提高了分辨能力。但由于其孔徑相當(dāng)大，對(duì)大多數(shù)蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)其分子篩效應(yīng)微不足道，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于核酸的研究中。蛋白質(zhì)和核酸會(huì)根據(jù)pH不同帶有不同電荷，在電場(chǎng)中受力大小不同，因此跑的速度不同，根據(jù)這個(gè)原理可將其分開(kāi)。電泳緩沖液的pH在6?9之間，離子強(qiáng)度0.02~0.05為最適。常用1%的瓊脂糖作為電泳支持物。瓊脂糖凝膠約可區(qū)分相差10Obp的DNA片段，其分辨率雖比聚丙烯酰胺凝膠低，但它制備容易，分離范圍廣。普通瓊脂糖凝膠分離DNA的范圍為0.2-20kb，利用脈沖電泳，可分離高達(dá)107bp的DNA片段。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的pH溶液中帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動(dòng)。質(zhì)粒DNA的形態(tài)不一，電泳時(shí)在凝膠中的遷移率不同。超螺旋的質(zhì)粒DNA一般遷移最快、開(kāi)環(huán)（缺口）質(zhì)粒DNA遷移最慢，線化DNA位于兩者之間。本實(shí)驗(yàn)采用EB對(duì)DNA進(jìn)行染色，紫外線照射下呈綠色熒光，可清除看到質(zhì)粒DNA所在位置［3］。2.2實(shí)驗(yàn)材料2.2.1菌種所用菌種為配置好的大腸桿菌菌液。2.2.2藥品及試劑所用藥品及試劑有溶液I：25mMTris-HCl（pH8.0）,10mMEDTA（pH8.0）,50mM葡萄糖；溶液II:0.2MNaOH,1%SDS（使用前以10NNaOH與10%SDS稀釋配制）；溶液III：3M醋酸鉀溶液（KAc,pH5.2）；異丙醇（isopropanol）；酚/氯仿（1：1）溶液；RNaseA:1mg/ml；1xTAE緩沖液：40mMTris-乙酸，1mMEDTA（pH8.0）；TE緩沖液；DNAmarker：DL2000；50xTAE電泳緩沖液；瓊脂糖；熒光染料；loadingbuffer等。實(shí)驗(yàn)儀器用具用到的儀器及用具有臺(tái)式型離心機(jī)；旋渦混合器；移液槍?zhuān)画傊悄z電泳；紫外線透射儀等。實(shí)驗(yàn)方法將菌液分2次集于1.5ml離心管中，4000rpm離心1min，棄去上清液。然后加入100ul預(yù)冷的溶液I，在漩渦振蕩器上劇烈震蕩，充分懸浮菌體。接著加入200ul溶液II，輕柔顛倒幾次，將離心管放于冰上1min。加入150ul預(yù)冷的溶液III，輕柔顛倒幾次，放冰上3?5min。然后加入等體積酚/氯仿（1：1）溶液450ul，顛倒均勻。15000rpm下離心10min。離心完畢后，將上清液放入另一干凈離心管中，加入與所取上清等體積酚/氯仿（1：1）溶液，顛倒混勻。將所得上清放入另一干凈離心管中，加入2倍體積預(yù)冷的異丙醇，顛倒均勻，-20°C放置30min。取出后于15000rpm下離心10min。取出后去上清，用200ul70%乙醇吹打懸浮沉淀，再于15000rpm下離心5min，去70%乙醇洗滌液，用槍洗凈殘留溶液，將其置于超凈工作臺(tái)內(nèi)吹干。待吹干后，加入20ulTE溶液溶解DNA。用膠帶將制膠板兩頭封嚴(yán)，然后配0.9%瓊脂糖凝膠30ml:稱取0.27g瓊脂糖加入1XTAE緩沖液30ml，用微波爐溶膠。冷卻至不燙手加熒光染料2ul混勻，倒

膠，立即插上梳子，冷卻20min,輕輕拔出梳子，立即將凝膠板放入電泳槽，倒入lxTAE電泳緩沖液，使電泳液完全沒(méi)過(guò)膠。將5ul質(zhì)粒DNA與lulloadingbuffer混勻點(diǎn)入點(diǎn)樣孔，最后點(diǎn)5ulDNAMarker。鏈接電泳槽，注意正負(fù)極，DNA從負(fù)極向正極跑，100V跑約25分鐘，然后帶手套將膠小心從膠板上拿起，放在紫外燈下照射拍照。3結(jié)果將電泳后的瓊脂糖凝膠放在紫外燈的照射下觀察結(jié)果，拍照得到DNA的電泳條帶如圖1所示，其中從右數(shù)第2個(gè)電泳條帶為自己的，第3個(gè)電泳條帶為DNAMarker。圖2為DNAMarker的電泳條帶圖示。圖2DNAMarker圖2DNAMarker瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果4討論4.1對(duì)實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的分析及其結(jié)論從圖1右二電泳結(jié)果看，可以看到有三條較為清晰的條帶。其中跑在最前方的電泳條帶代表RNA，后兩條是提取出的質(zhì)粒DNA。之所以會(huì)出現(xiàn)多條條帶，是因?yàn)樵谡麄€(gè)質(zhì)粒提取過(guò)程中，由于機(jī)械力、酸堿度、試劑等的原因，可能使質(zhì)粒DNA鏈發(fā)生斷裂，因此多數(shù)質(zhì)粒提取物中含有三種構(gòu)型的質(zhì)粒：共價(jià)閉合環(huán)狀DNA、開(kāi)環(huán)DNA、線形DNA，其中共價(jià)閉合環(huán)狀DNA一般遷移最快，開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA遷移最慢，線形DNA位于兩者之間。由后兩條帶的亮度可知，跑在前面的條帶更亮，因此此條帶可能代表了共價(jià)閉合環(huán)狀DNA，后面一個(gè)條帶可能為開(kāi)環(huán)DNA或線形DNA。將自己做的電泳條帶與DNAMarker相對(duì)照，可以大概判斷出提取的質(zhì)粒DNA的堿基對(duì)數(shù)目約為3kb。從整體的電泳效果來(lái)看，電泳條帶均清晰可見(jiàn)，亮度適宜，本次試驗(yàn)做得較為成功。4.2對(duì)實(shí)驗(yàn)分析及其結(jié)論4.2.1三種溶液的作用溶液I的作用：懸浮大腸桿菌菌體，而且加溶液I后必須要將菌體懸浮徹底，不得有塊狀或大顆粒狀呈現(xiàn)，是質(zhì)粒DNA提取的首要關(guān)鍵。且其中含有的溶酶菌可以水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的01,4糖苷鍵，因而具有溶菌作用。另外葡萄糖的作用是使懸浮后的大腸桿菌不會(huì)很快沉積到管子的底部，增加溶液的粘度，維持滲透壓及防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，在溶液I中加入EDTA，是要把大腸桿菌細(xì)胞中的二價(jià)金屬離子都螯合掉，從而起到抑制DNase對(duì)DNA的降解和抑制微生物生長(zhǎng)的作用。另外也可保證溶菌酶活性。溶液II的作用：提供堿性條件，在NaOH與SDS的共同作用下是大腸桿菌瞬間裂解，并變性核DNA。當(dāng)細(xì)胞懸浮于NaOH和十二烷基酸鈉（SDS）溶液中使在高pH的作用下細(xì)胞發(fā)生裂解，此外蛋白質(zhì)和染色體DNA發(fā)生變性與細(xì)胞碎片一起沉淀下來(lái)。這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從雙層膜結(jié)構(gòu)想微囊結(jié)構(gòu)的相變化。新配制的溶液II避免作為最佳溶解細(xì)胞的試劑NaOH接觸空氣中的CO2過(guò)久而減弱了堿性。用不新鮮的0.4MNaOH,即便有SDS也無(wú)法有效溶解大腸桿菌。因此必須使用新鮮的0.4MNaOH試劑進(jìn)行配制。溶液III的作用：該溶液所含有的高濃度鉀離子與溶液體系中的十二烷基磺酸鈉發(fā)生反應(yīng)形成十二烷基磺酸鉀，從而將與之結(jié)合的絕大部分大腸桿菌蛋白質(zhì)以及很長(zhǎng)的基因組DNA一起沉淀，與質(zhì)粒分離開(kāi)來(lái)；另外溶液III所含有的醋酸是為了中和NaOH,因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的堿性條件會(huì)打斷DNA。基因組DNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50-100kb大小的片段，就沒(méi)有辦法再被PDS共沉淀，這樣就跟質(zhì)粒DNA共存了。而且在整個(gè)質(zhì)粒DNA的提取過(guò)程中，沉淀DNA時(shí)用無(wú)水乙醇及在高鹽、低溫條件下進(jìn)行都是為了用化學(xué)或物理手段將基因組DNA分子和蛋白質(zhì)發(fā)生變性、在體系中的溶解度降低，較充分的分離提純出實(shí)驗(yàn)所需的質(zhì)粒DNA。4.2.2酚氯仿抽提DNA體系后出現(xiàn)的現(xiàn)象及其成因水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液，離心后酚相會(huì)跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水相的回收；加入氯仿后可以增加比重，使得酚\氯仿始終在下層，方便水相的回收。酚與水有很大的互溶性，如果單獨(dú)用酚抽提后會(huì)有大量的酚溶解到水相中，而酚會(huì)抑制很多酶反應(yīng)。而且含質(zhì)粒DNA的水相會(huì)部分進(jìn)入到酚中，造成損失。添加異戊醇，主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，方便了水相的回收。4.2.3要將DNA保存于TE緩沖液中的原因在基因操作實(shí)驗(yàn)中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。采用Tris-HCl的緩沖系統(tǒng)，由于緩沖對(duì)是Tris+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時(shí)大都采用Tris-HCl系統(tǒng)，而TE緩沖液中的EDTA能螯合金屬離子，抑制DNase的活性，更難穩(wěn)定DNA。4.3實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)制備質(zhì)粒過(guò)程中，所有操作必須緩和，不要?jiǎng)×艺鹗?，以避免機(jī)械剪切力對(duì)DNA的斷裂作用。同時(shí)也應(yīng)防止DNase因其DNA的降解。酚/氯仿有強(qiáng)腐蝕性，使用時(shí)要格外小心，不要弄到手上，必要時(shí)帶手套。加入乙酸鉀溶液后，可用小玻璃棒輕輕攪開(kāi)團(tuán)狀沉淀物，防止質(zhì)粒DNA可能被包埋在沉淀物內(nèi)，不易釋放出來(lái)。用酚/氯仿混合液除去蛋白效果比單獨(dú)作用酚或氯仿更好。為充分除去殘余的蛋白質(zhì)，可以進(jìn)行多次抽提，直至兩相間無(wú)絮狀蛋白沉淀。提取的各步操作盡量在低溫條件下進(jìn)行（冰浴上）。4.4結(jié)語(yǔ)和展望瓊脂糖凝膠上DNA染色是核酸分析研究中的一個(gè)重要領(lǐng)域，目前其問(wèn)題主要集中在如何提高染色靈敏度，使操作簡(jiǎn)捷，以及降低試劑毒性和費(fèi)用等方面。前人雖經(jīng)過(guò)不懈努力取得了一定