基于冰凍銑切技術(shù)的大鼠腸道系統(tǒng)高分辨解剖模型的構(gòu)建

基于冰凍銑切技術(shù)的大鼠腸道系統(tǒng)高分辨解剖模型的構(gòu)建

隨著人類科學(xué)研究的結(jié)束和后基因組時(shí)代的開始，科學(xué)和學(xué)術(shù)界越來越多地將生物信息整合到分子、細(xì)胞、組織和器官，并將單個(gè)、局部、分散和無序數(shù)據(jù)和信息整合到完整的系統(tǒng)、擴(kuò)展和挖掘。適應(yīng)這一需求,出現(xiàn)了高分辨解剖數(shù)據(jù)集的研究,由于其具有定量計(jì)算及數(shù)據(jù)整合的功能,這為定量研究生理功能及生理建模研究提供了基礎(chǔ),現(xiàn)階段高分辨解剖數(shù)據(jù)集已成為國際研究的熱點(diǎn)之一,而在解剖集的基礎(chǔ)上建立各種生物結(jié)構(gòu)的數(shù)字化三維模型則是高分辨解剖數(shù)據(jù)集研究的重要一環(huán)。腸道系統(tǒng)在高等動(dòng)物體內(nèi)扮演著非常重要的功能,如食物的消化、營(yíng)養(yǎng)的吸收、廢物的排泄以及參與體內(nèi)免疫反應(yīng);另外,腸道系統(tǒng)內(nèi)還含有大量的微生物菌群,參與調(diào)節(jié)腸道內(nèi)環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)吸收、免疫應(yīng)答等。大鼠是一種常用的實(shí)驗(yàn)室小動(dòng)物,是進(jìn)行生理及營(yíng)養(yǎng)學(xué)實(shí)驗(yàn)的較好的模式動(dòng)物,其腸道系統(tǒng)常被作為“替代”用于人的腸道的營(yíng)養(yǎng)、免疫及有益菌群的研究。建立一套高精度的大鼠腸道系統(tǒng)的解剖數(shù)據(jù)集,并基于此構(gòu)建出其數(shù)字化三維模型,無疑將大大有助于對(duì)高等動(dòng)物腸道系統(tǒng)功能與結(jié)構(gòu)關(guān)系的研究。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的準(zhǔn)備1.1.1大鼠皮膚急性毒性試驗(yàn)選用150g左右的雄性SD大白鼠(購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心),大白鼠經(jīng)肉眼及X-Ray檢視,確認(rèn)無任何損傷,無明顯遺傳性缺陷、身體健康且勻稱方用于試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前用10%的烏拉坦溶液腹部注射大鼠,待其完全麻醉后,用毛剪將其全身披毛盡量剪短,再用7%的Na2S溶液擦拭全身以脫去其披毛。脫完毛后的大鼠用過量CO2安樂處死。1.1.2大鼠的正截面整形處死后的大鼠樣本立即進(jìn)行整形處理,整形的原則是:大鼠的頭部,背部及尾部成一條直線,身體兩側(cè)基本對(duì)稱,整形后則將樣本轉(zhuǎn)入-85℃冰箱中冷凍固定24h以上,以確保大鼠被徹底冷凍。1.1.3亞甲藍(lán)用量的影響包埋采用新鮮配制的3%的明膠溶液(3g明膠,100ml雙蒸水),并加入易與樣品區(qū)分的染色劑亞甲藍(lán)(0.25g亞甲藍(lán),100ml明膠溶液)。為了使包埋簡(jiǎn)單易行,采用了臥式包埋的方式。包埋過程則使用了逐層包埋逐層冷凍的方式。包埋好的樣品轉(zhuǎn)入-85℃冰箱中繼續(xù)冷凍72h以上。1.2樣品的預(yù)處理圖像采集是在特制的小動(dòng)物切削成像系統(tǒng)上進(jìn)行。小動(dòng)物切削成像系統(tǒng)由高精度銑床、成像系統(tǒng)以及制冷設(shè)備(-10℃冷庫)三部份組成。冷凍好的樣品塊被固定在銑床載物臺(tái)上。切削時(shí),樣品切削的層厚設(shè)置為0.020mm,即每切削一次,銑刀沿Z軸方向向下運(yùn)行0.020mm;銑床完成一個(gè)工作流程的時(shí)間定為3min。成像系統(tǒng)則由掃描儀和計(jì)算機(jī)構(gòu)成,采用定焦距采集的方式,即掃描儀與銑刀一起運(yùn)動(dòng),每采集一幅圖像,立刻通過數(shù)據(jù)線轉(zhuǎn)移到冷庫外的計(jì)算機(jī)上并存儲(chǔ)。切削的整個(gè)過程都是在冷庫中進(jìn)行。整個(gè)圖像的采集采用了連續(xù)切削的方式,即24h不停機(jī)連續(xù)切削。1.3處理完1.3.1好的連續(xù)性與保證由于采用了定焦距采集以及連續(xù)切削的方式,大多數(shù)圖像保持了較好的連續(xù)性。但是連續(xù)長(zhǎng)時(shí)間切削過程中,機(jī)床亦會(huì)因?yàn)檫\(yùn)行異常、人為操作以及機(jī)床本身的誤差等因素導(dǎo)致少部分圖像的不連續(xù),針對(duì)這些圖像,我們主要根據(jù)圖像內(nèi)部的解剖學(xué)標(biāo)志點(diǎn)來進(jìn)行配準(zhǔn)。1.3.2腸道系統(tǒng)圖像分割在配準(zhǔn)后的圖像上選擇含有腸道系統(tǒng)的斷層切片進(jìn)行分割。由于冰凍斷面上不同部位的顏色分布不均勻,導(dǎo)致自動(dòng)分割的效果很差,因此,腸道系統(tǒng)的圖像分割采用了手工分割的方法,即用Photoshop的套索工具對(duì)每幅圖像的腸道外輪廓進(jìn)行分割,分割后的斷面見圖1。1.3.3并行面建模技術(shù)圖像重建則采用了面繪制算法,利用VisualC++和VisualizationToolKit(VTK)工具包,基于MPI平臺(tái),采用浪潮天梭10000高性能計(jì)算集群系統(tǒng)(INFINIBAND版),在并行計(jì)算環(huán)境中采用Master-Slave模型實(shí)現(xiàn)并行面繪制計(jì)算,面繪制采用MarchingCubes(MC)算法。2結(jié)果與討論2.1腸道結(jié)構(gòu)的二維特性共獲取了高精度的大鼠腹部的冰凍斷面圖像3000張(單張圖片像素大小為0.020mm×0.020mm)。圖1為對(duì)腹部斷面圖像上的腸道輪廓分割后獲得的大鼠腸道系統(tǒng)解剖數(shù)據(jù)集的二維圖像,圖中可見小腸、結(jié)腸及盲腸在斷面上呈現(xiàn)相互交錯(cuò)的分布,不同的結(jié)構(gòu)可通過顏色將其區(qū)分開來,如小腸呈淡紅色、結(jié)腸則顏色較深,盲腸的顏色則略現(xiàn)暗色。另外,從圖中亦可以看出,不同的腸在斷面上呈現(xiàn)不同的解剖構(gòu)造,而這即構(gòu)成了腸道系統(tǒng)的各部分分工合作的前提和基礎(chǔ)。2.2大鼠腸道系統(tǒng)的外觀構(gòu)造圖2所示即為對(duì)數(shù)據(jù)集重建后獲得的大鼠腸道系統(tǒng)的三維模型。圖中用箭頭標(biāo)識(shí)了大鼠腸道系統(tǒng)的各部分結(jié)構(gòu),如十二指腸、空腸、盲腸、結(jié)腸和直腸,這些結(jié)構(gòu)相互間緊密盤結(jié),共同構(gòu)成了大鼠獨(dú)有的腸道系統(tǒng)的外觀構(gòu)造。2.3數(shù)字冰激凌銑切層圖像的特征構(gòu)建解剖數(shù)據(jù)集及三維模型的方法有多種,較為常見的是利用影像學(xué)技術(shù),如CT、MRI等。采用冰凍銑切成像技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是:由于腸道系統(tǒng)的信息直接來源于實(shí)物切片,相比于影像學(xué)技術(shù),基于冰凍銑切斷層圖像獲得的腸道系統(tǒng)的信息更為豐富、真實(shí)。影像學(xué)技術(shù)中,CT本身就對(duì)腸等軟組織的成像能力弱,而MRI雖然對(duì)軟組織的成像能力較強(qiáng),但也只能成灰度圖像,且細(xì)節(jié)顯示能力弱于冰凍銑切圖像;另外,影像學(xué)技術(shù)由于偽影以及重建算法本身的問題,在對(duì)身體深層的細(xì)小的解剖結(jié)構(gòu)的顯示方面存在著一定的困難,而基于冰凍銑切斷層圖像構(gòu)建三維模型的方法則能較好地顯示各個(gè)部分的細(xì)節(jié)信息。如圖1中無論身體內(nèi)部還是外側(cè)的各個(gè)部分的腸的信息都能很清晰地顯示出來。而這些因素即保證了最終獲得的大鼠腸道系統(tǒng)的解剖數(shù)據(jù)集及三維模型的“高質(zhì)量”和“高分辨率”。所構(gòu)建的數(shù)字化大鼠腸道系統(tǒng)高分辨解剖集及三維模型,為從系統(tǒng)的角度、定量地研究高等動(dòng)物腸道系統(tǒng)的生理功能與結(jié)構(gòu)的關(guān)系提供了基礎(chǔ)。目前有關(guān)大鼠腸道系統(tǒng)的研究較多,主要集中在免疫、營(yíng)養(yǎng)以及腸道代謝紊亂等與人類健康較為密切的領(lǐng)域,且相關(guān)的研究較為分散,而研究的范圍又涉及到從微觀層次,如免疫分子的基因表達(dá)與調(diào)控,到宏觀層次,如腸道免疫對(duì)整個(gè)機(jī)體的影響等。高分辨大鼠腸道系統(tǒng)解剖數(shù)據(jù)集的建立,則為整合這些從微觀到宏觀、分散、無序的腸道系統(tǒng)的數(shù)據(jù)提供了基礎(chǔ),而數(shù)字化三維模型則有助于將這些信息進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為容易接受和理解的形式,從而方便后續(xù)的“知識(shí)”的發(fā)現(xiàn)與“挖掘”。3基于數(shù)字化建模的巷道系統(tǒng)整合與結(jié)構(gòu)的分析生命過程的定量研究與系統(tǒng)整合是目前國際上前沿課題之一。基于冰凍銑切