瓊脂糖膠原復(fù)合水凝膠的制備及性能評(píng)價(jià)

瓊脂糖膠原復(fù)合水凝膠的制備及性能評(píng)價(jià)

組織工程是一門將工程科學(xué)、長(zhǎng)壽科學(xué)相結(jié)合發(fā)展而來的新興學(xué)科。其核心是在細(xì)胞和生物材料之間建立一個(gè)三維共生組織，即具有生命力的活著組織，重建病害變輕的組織，并達(dá)到長(zhǎng)期功能替代的目的。其中,支架作為組織工程的核心要素,是細(xì)胞生長(zhǎng)的模板和載體,對(duì)構(gòu)建活性組織和器官具有重要意義。首先,支架應(yīng)具有良好的生物性能,即細(xì)胞毒性小,降解產(chǎn)物危害小,免疫排異反應(yīng)小,適合細(xì)胞貼附等。其次,支架還需有適宜的力學(xué)性能和降解性能,這樣才能將空間結(jié)構(gòu)維持足夠長(zhǎng)的時(shí)間,滿足細(xì)胞三維生長(zhǎng)的需求。此外,支架還應(yīng)具有合理的管道設(shè)計(jì),以模仿自然的血管系統(tǒng)為支架內(nèi)部的細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與氧氣。天然可降解生物支架材料因來源于生物體本身而具有良好的生物相容性,因而成為組織工程支架材料的研究重點(diǎn)。例如,絲素蛋白/明膠多孔復(fù)合材料因其力學(xué)性能、降解性、生物相容性等方面具有明顯優(yōu)勢(shì),在軟骨、韌帶及肝組織工程等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用,但該多孔材料不利于細(xì)胞均勻接種。水凝膠作為一種富含水分的軟質(zhì)材料,與體內(nèi)軟質(zhì)組織與器官基質(zhì)材料相似,并具有良好的生物相容性、細(xì)胞接種方便、適宜的機(jī)械性能等優(yōu)勢(shì)備受研究人員的青睞。在一系列人工合成和天然水凝膠材料中,膠原蛋白來自于生物體內(nèi),其免疫排異反應(yīng)小,而且其交聯(lián)過程不需引入其他化學(xué)試劑,所以生物性能尤為突出。但是,膠原水凝膠成形性能差,難以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的支架結(jié)構(gòu)制造,并且其降解速度很快,在體內(nèi)環(huán)境難以與組織生長(zhǎng)速度相匹配,這限制了膠原蛋白水凝膠在微結(jié)構(gòu)組織工程中的廣泛應(yīng)用。針對(duì)該問題,研究者提出了許多解決方案,如戊二醛交聯(lián)、紫外線光照等,但這些方法對(duì)膠原水凝膠的成形性能影響不大,并且將直接影響細(xì)胞活性。瓊脂糖作為一種天然多糖材料,具有細(xì)胞無毒性、降解緩慢、材料成本低等特點(diǎn)。通過降低溶液溫度可以成形出在37℃左右穩(wěn)定的水凝膠結(jié)構(gòu),隨著瓊脂糖濃度的增加,所制備的水凝膠的彈性模量便會(huì)相應(yīng)增大幾個(gè)數(shù)量級(jí)。最近,有研究者將瓊脂糖與膠原復(fù)合以制備具有良好性能的復(fù)合水凝膠材料,并對(duì)復(fù)合材料與細(xì)胞的微觀作用機(jī)理進(jìn)行了探討,但是并未對(duì)復(fù)合水凝膠的微結(jié)構(gòu)成形性能、力學(xué)性能及體內(nèi)相容性進(jìn)行研究?；诖?本文重點(diǎn)研究了不同濃度的瓊脂糖和膠原復(fù)合材料對(duì)所制備的水凝膠的力學(xué)性能、成形性能、細(xì)胞相容性能及體內(nèi)免疫排異性能的影響,以期得到最優(yōu)綜合性能的瓊脂糖/膠原復(fù)合水凝膠材料。14復(fù)合水凝膠的制備和性能測(cè)試1.1血清因子及體外細(xì)胞氧化劑實(shí)驗(yàn)材料:瓊脂糖(GENE公司)、鼠尾膠原(本實(shí)驗(yàn)室提供)、冰乙酸(CH3COOH)、氯仿(CHCl3)、DMEM高糖培養(yǎng)液(Gibico)、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、大鼠肺成纖維細(xì)胞、live/dead染色劑、CCK-8染色劑。實(shí)驗(yàn)設(shè)備:CMT6503微機(jī)控制電子萬能試驗(yàn)機(jī)(MTSSYSTEMS(CHINA)Co.Ltd)、等離子清洗機(jī)(HarrickPlasma,美國)、超凈臺(tái)、離心機(jī)、恒溫培養(yǎng)箱、熒光顯微鏡、酶標(biāo)儀。1.2原材料的制備1.2.1膠原海綿的制備從鼠尾中抽離出鼠尾肌腱纖維,剪碎后置于體積濃度為0.1%的CH3COOH(冰乙酸)溶液中振蕩約3d,將獲得的黏稠溶液分裝于離心管中,使用離心機(jī)離心2h;取離心后獲得的上清液,置于凍干機(jī)中,-20℃凍干48h,得到膠原海綿;將膠原海綿再次用體積濃度為0.1%的冰乙酸溶解后,離心取上清液,以獲得有菌膠原溶液;將膠原溶液置于透析袋中(截留相對(duì)分子質(zhì)量為3500D),置于體積濃度為0.1%的冰乙酸中透析1h,取出后置于體積濃度為1%的CHCl3(氯仿)溶液中透析1h;準(zhǔn)備體積濃度為0.1%的無菌冰乙酸,將透析袋置于其中,在磁力攪拌器上緩慢攪拌,每隔1d用無菌冰乙酸換液,直至7d透析完成,在4℃條件下保存待用。1.2.2瓊脂糖溶液的配制將一定量的瓊脂糖溶液和去離子水混合,并將混合溶液放置在磁力攪拌器上,邊攪拌邊加熱,等溶液沸騰后,瓊脂糖便完全溶解,溶液呈透明狀。將該溶液置于95℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?.3封膠材料的確定膠原溶液與瓊脂糖溶液的保存條件及成膠方式有很大差異:(1)膠原在4℃條件下保存可保持其原有活性,其成膠條件應(yīng)結(jié)合溫度、pH值和離子濃度,當(dāng)溶液pH值調(diào)為7.4時(shí),保證零度以上環(huán)境以及合適的離子濃度便可成膠,本課題組已對(duì)其成膠溫度進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)4℃、室溫以及37℃條件下對(duì)其成膠無顯著影響,而考慮到包裹細(xì)胞時(shí)4℃可能會(huì)影響細(xì)胞的活性,因此選用37℃作為適宜的成膠溫度;(2)瓊脂糖在60~90℃條件下可保持較好的流動(dòng)性,在37℃左右可成形穩(wěn)定的水凝膠結(jié)構(gòu)。由以上兩種材料的成膠特性可知,因其存在較大溫度差,將膠原溶液與瓊脂糖溶液混合在一起時(shí),有可能導(dǎo)致其中一方先成膠,而無法灌注到模具中,應(yīng)保證混合后溶液的溫度稍高于37℃,同時(shí)膠原溶液在pH值達(dá)到7.4時(shí)才可成膠,因此我們?cè)O(shè)計(jì)兩種復(fù)合方式,如圖1a所示。方式一:先將膠原pH值調(diào)為7.4,再和瓊脂糖溶液混合制備出瓊脂糖和膠原的混合液,然后注入到無結(jié)構(gòu)模具中,待1h后材料完全成膠脫模,得到瓊脂糖/膠原復(fù)合水凝膠。方式二:先將膠原與瓊脂糖溶液混合后,將混合液的pH值調(diào)為7.4,制備瓊脂糖/膠原復(fù)合水凝膠。圖1b所示為兩種復(fù)合方式下所制備復(fù)合水凝膠的微觀形態(tài)。方式一制備的水凝膠內(nèi)部有絮狀物,應(yīng)為部分膠原先成膠所致,方式二制備的水凝膠內(nèi)部呈透明狀,無絮狀物,因此選用方式二制備瓊脂糖/膠原復(fù)合水凝膠。如表1所示,本文制備了多種相同膠原(C)濃度與不同瓊脂糖(A)濃度的瓊脂糖/膠原復(fù)合水凝膠,以膠原水凝膠作為對(duì)照組,比較其力學(xué)性能、微結(jié)構(gòu)成形性及生物相容性。1.4應(yīng)力-應(yīng)變本構(gòu)模型使用微機(jī)控制的CMT6503型萬能試驗(yàn)機(jī)測(cè)試支架的力學(xué)性能,測(cè)試之前將支架在磷酸鹽緩沖液(phosphatebufferedsaline,PBS)中浸泡24h,加載速度為1mm/min,每種支架測(cè)試3個(gè)樣品,繪出應(yīng)力-應(yīng)變曲線,得到平均的壓縮模量。壓縮模量定義為應(yīng)力-應(yīng)變曲線初始線性部分的斜率,即應(yīng)變?yōu)?%至10%的部分。此外,將另一批支架在PBS緩沖液中分別浸泡3d、7d,用相同的方法測(cè)試支架的長(zhǎng)期力學(xué)性能。1.5微結(jié)構(gòu)水凝膠的制備實(shí)驗(yàn)中采用了如圖2所示的模型作為研究水凝膠微結(jié)構(gòu)成形性能的標(biāo)準(zhǔn)模型。首先在Pro/Engineer中設(shè)計(jì)數(shù)字化模型(見圖2a),使用快速成型國家工程中心的SPS600B快速成型機(jī)制造樹脂模具(見圖2b),翻模獲得包含微結(jié)構(gòu)負(fù)型的硅膠模具(見圖2c)。硅膠模具在使用前應(yīng)進(jìn)行等離子清洗改善其親水性,便于溶液灌注到微結(jié)構(gòu)中。然后將配置好的瓊脂糖/膠原混合溶液以及純膠原溶液分別灌注到設(shè)計(jì)有微結(jié)構(gòu)的硅膠模具中,于37℃環(huán)境下靜置1h后將模具浸泡于PBS溶液中,使用鑷子將水凝膠脫模,得到不同瓊脂糖濃度的微結(jié)構(gòu)水凝膠。使用數(shù)碼相機(jī)對(duì)水凝膠拍照時(shí),均保持水凝膠脫離PBS溶液。1.6瓊脂糖/膠原復(fù)合水凝膠法為評(píng)價(jià)所制備的水凝膠復(fù)合材料對(duì)細(xì)胞相容性的影響,將密度為1×106/mL的原代遠(yuǎn)交群(SD)大鼠肺成纖維細(xì)胞與不同配比的瓊脂糖/膠原混合液、膠原溶液混合均勻后注入到無菌模具中,1h后脫模得到包含細(xì)胞的瓊脂糖/膠原復(fù)合水凝膠、膠原水凝膠。然后置于24孔板中,每孔加入1mLDMEM培養(yǎng)液(含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清和0.2%的青霉素與鏈霉素),置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每天更換培養(yǎng)液。在第1、第3天用死活染色劑對(duì)水凝膠內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行死活染色,用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察,細(xì)胞增殖情況用CCK-8試劑進(jìn)行測(cè)定。1.7sd大鼠方式的水凝膠植入實(shí)驗(yàn)選取一種兼?zhèn)淞己昧W(xué)性能、微結(jié)構(gòu)成形性及細(xì)胞相容性的瓊脂糖/膠原復(fù)合水凝膠,測(cè)試其體內(nèi)免疫排異性,并與0.6C水凝膠進(jìn)行對(duì)比。將上述兩種水凝膠溶液注入到無菌模具中,1h后脫模制備出所需水凝膠,然后進(jìn)行SD大鼠腹腔大網(wǎng)膜植入實(shí)驗(yàn),其中每只SD大鼠腹腔植入4個(gè)水凝膠樣本。手術(shù)后第3天、第10天用戊巴比妥鈉麻醉SD大鼠后,自原切口切開,將水凝膠及周圍包裹的組織分離取材,于10%甲醛溶液中固定48h,進(jìn)行組織切片與H&E染色觀察,每組為4個(gè)平行樣本。2水凝膠性能試驗(yàn)結(jié)果2.1復(fù)合水凝膠的壓縮模量應(yīng)用微機(jī)控制的CMT6503型萬能試驗(yàn)機(jī)測(cè)試水凝膠的力學(xué)性能結(jié)果如圖3所示。圖3a為水凝膠在PBS中浸泡24h后所測(cè)得的壓縮模量的結(jié)果,復(fù)合水凝膠的壓縮模量遠(yuǎn)高于膠原水凝膠的壓縮模量,其中0.3C/0.4A的壓縮模量約為0.6C的5倍。此外,隨著復(fù)合水凝膠中瓊脂糖濃度的提高,其壓縮模量逐步增大。圖3b中,水凝膠在PBS中分別浸泡3d、7d,其壓縮模量相對(duì)于浸泡1d的均無明顯變化,說明復(fù)合水凝膠具有較強(qiáng)的體外力學(xué)穩(wěn)定性。2.2復(fù)合水凝膠的成形性能在微結(jié)構(gòu)成形實(shí)驗(yàn)中,4種不同配比的復(fù)合水凝膠與膠原水凝膠在PBS緩沖液中均可脫模,但0.6C各樣本微結(jié)構(gòu)破損很明顯,由于其力學(xué)強(qiáng)度太低,一旦脫離PBS溶液結(jié)構(gòu)均無法保持(見圖4a)。0.3C/0.3A復(fù)合水凝膠雖然微結(jié)構(gòu)不是很清晰,但相比0.6C成形性已有較大改善(見圖4b)。0.3C/0.4A復(fù)合水凝膠已經(jīng)可以完全復(fù)型出所設(shè)計(jì)的微結(jié)構(gòu),具有良好的成形性能(見圖4c)。0.3C/0.5A復(fù)合水凝膠成形性則更好(見圖4d)。因此,0.3C/0.4A、0.3C/0.5A復(fù)合水凝膠均具有良好微結(jié)構(gòu)成形性。2.3水凝膠細(xì)胞的鋪展生長(zhǎng)應(yīng)用死活染色方法測(cè)試的細(xì)胞生長(zhǎng)情況如圖5所示(本實(shí)驗(yàn)只比較活細(xì)胞增殖結(jié)果),測(cè)試材料分別為0.6C、0.3C/0.3A、0.3C/0.4A、0.3C/0.5A、0.3C/0.6A。其中,0.6C與復(fù)合水凝膠組相比,細(xì)胞有較大增殖,第3天時(shí)細(xì)胞在膠原水凝膠內(nèi)部完全鋪展生長(zhǎng),而復(fù)合水凝膠組內(nèi)部的細(xì)胞均未完全鋪展,且細(xì)胞數(shù)量在第1天內(nèi)無顯著差異。0.6C、0.3C/0.3A、0.3C/0.4A這3組中的細(xì)胞數(shù)量在第3天時(shí)間里均較其他兩組有較大增長(zhǎng),而0.3C/0.5A、0.3C/0.6A這兩組的細(xì)胞數(shù)量第3天較第1天幾乎沒有增多,且細(xì)胞狀態(tài)很差,說明0.3C/0.5A、0.3C/0.6A中的瓊脂糖濃度偏高,水凝膠內(nèi)部纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)過于致密而不適合成纖維細(xì)胞鋪展及增殖。應(yīng)用CCK-8試劑測(cè)試的4種不同配比的復(fù)合水凝膠的細(xì)胞增殖結(jié)果如圖6所示,結(jié)果表明:培養(yǎng)第1天后,0.6C中的細(xì)胞數(shù)量最高,4種復(fù)合水凝膠中的細(xì)胞數(shù)量差異不大;培養(yǎng)第3天后,0.3C/0.3A、0.3C/0.4A中的細(xì)胞有較大增殖,0.3C/0.5A、0.3C/0.6A中細(xì)胞數(shù)量幾乎不變,因此0.6C、0.3C/0.3A、0.3C/0.4A具有良好生物相容性。2.4h&e切片染色通過對(duì)不同配比水凝膠的力學(xué)性能、成形性能及細(xì)胞相容性實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,選取0.3C/0.4A復(fù)合水凝膠進(jìn)行體內(nèi)免疫排異實(shí)驗(yàn)。于第3天、第10天將水凝膠及周圍包裹的組織分離取材進(jìn)行H&E切片染色,染色結(jié)果如圖7所示。0.3C/0.4A水凝膠周圍的炎癥細(xì)胞較0.6C多,但均屬于較低的免疫排異反應(yīng)。此外,0.3C/0.4A水凝膠的降解速度較慢,10d內(nèi)材料無明顯降解,炎癥細(xì)胞多分布在支架周圍,而0.6C降解嚴(yán)重,炎癥細(xì)胞在支架內(nèi)部和周圍分布均勻。3瓊脂糖/膠原復(fù)合水凝膠的制備及其性能組織工程支架為細(xì)胞提供依附生長(zhǎng)的載體,其材料構(gòu)成及微結(jié)構(gòu)特征均會(huì)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響,因此良好的組織工程支架需兼?zhèn)渖锵嗳菪院臀⒔Y(jié)構(gòu)成形性,但目前的支架材料往往難以達(dá)到此要求。膠原蛋白因其優(yōu)越的生物學(xué)性能而廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域,但其成形性能差,難以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜微結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)。然而,良好的結(jié)構(gòu)是維持人工組織中營(yíng)養(yǎng)供給、細(xì)胞生長(zhǎng)和功能表達(dá),以及血管化的重要手段。為了構(gòu)建具有仿生血管系統(tǒng)的組織工程支架,提高膠原水凝膠的強(qiáng)度及微結(jié)構(gòu)成型性成為當(dāng)前生物制造領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。文獻(xiàn)系統(tǒng)深入地分析了pH值、溫度、離子濃度等成膠條件對(duì)于膠原纖維直徑、孔徑大小的影響,從而改變其力學(xué)性能。但通過調(diào)節(jié)膠原的成膠條件僅能在很小范圍內(nèi)改變其力學(xué)強(qiáng)度。為此,文獻(xiàn)將0~0.01g/mL的瓊脂糖與0.0005g/mL膠原復(fù)合制備復(fù)合水凝膠,并對(duì)其儲(chǔ)能模量進(jìn)行測(cè)量,用以表征該材料的回彈性能。結(jié)果表明,隨著瓊脂糖的質(zhì)量濃度從0增加到0.010g/mL,水凝膠的儲(chǔ)能模量增大了兩個(gè)數(shù)量級(jí),揭示了復(fù)合瓊脂糖可大幅度提高膠原水凝膠力學(xué)性能的可能性。但是,該文并沒有對(duì)瓊脂糖/膠原的壓縮力學(xué)性能、結(jié)構(gòu)成形性及體內(nèi)免疫排異性能進(jìn)行研究。本文采用的瓊脂糖/膠原復(fù)合水凝膠制備方法,關(guān)鍵在于瓊脂糖與膠原復(fù)合方式的選取,即采用將瓊脂糖溶液與膠原溶液先等比混合再調(diào)節(jié)pH為7.4,然后置于37℃成膠的復(fù)合方式。包裹細(xì)胞時(shí)只需在調(diào)pH值后加入細(xì)胞團(tuán)吹打均勻,注入模具待其成膠即可。該方法對(duì)接種的細(xì)胞沒有毒副作用,可應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域。力學(xué)性能測(cè)試實(shí)驗(yàn)表明,不同配比的水凝膠在PBS溶液中浸泡1d后隨瓊脂糖濃度的增高其壓縮模量成倍增加,其中0.3C/0.4A的水凝膠壓縮模量約為0.6C的5倍,在PBS中浸泡3d、7d后各配比水凝膠壓縮模量均無明顯降低,說明該復(fù)合水凝膠力學(xué)性能穩(wěn)定。成形性測(cè)試實(shí)驗(yàn)表明,復(fù)合瓊脂糖后的水凝膠微結(jié)構(gòu)成形能力大幅度提高,0.3C/0.4A、0.3C/0.5A水凝膠均可完整復(fù)制出所設(shè)計(jì)的微結(jié)構(gòu),具有良好成形性。細(xì)胞相容性測(cè)試實(shí)驗(yàn)表明,隨著瓊脂糖濃度的增高水凝膠中細(xì)胞增殖數(shù)量下降,當(dāng)瓊脂糖質(zhì)量濃度達(dá)到0.004g/mL時(shí)為轉(zhuǎn)折點(diǎn),在第3天時(shí)0.3C/0.3A、0.3C/0.4A細(xì)胞數(shù)量均有較大增殖,而0.3C/0.5A、0.3C/0.6A細(xì)胞增殖幅度很小。0.3C/0.5A、0.3C/0.6A水凝膠中微觀纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)