代謝組學在中醫(yī)藥領域中的應用

代謝組學在中醫(yī)藥領域中的應用

代謝組學是后基因時代的一門新的“分子數(shù)學”學科。它的研究中心在于定量地測定由病理生理刺激或基因變異誘導的與時間相關的多參數(shù)生物體代謝應答,并利用模式識別(PatternRecognition)將這種應答與體內生物學事件關聯(lián),定位事件發(fā)生的靶器官和位點,確定生物標記物。自1999年代謝組學的概念提出以來,它在藥物毒理研究、疾病診斷、系統(tǒng)生物學研究等諸多領域里的應用日益深入。在代謝組學的溯源中常依據(jù)研究對象和主要技術手段的不同將代謝組學區(qū)分為Metabolomics和Metabonomics,二者分別由Metabolome、Metabonome演化而來,前者是由Fiehn等在以擬南芥為模型植物,研究植物生理代謝網(wǎng)絡時提出的,它的技術手段主要是GC-MS,同時兼用NMR;后者由Nicholson在長期研究生物體液的基礎上率先提出,主要基于NMR方法分析動物體的代謝過程,但隨著LC-MS技術的長足進步,HPLC-MS/MS(或者UPLC-MS/MS)技術在Metabonomics研究中的作用逐漸增強。生物體受外源性物質刺激或基因變異所導致的病理變化過程中,必然影響生物代謝網(wǎng)絡,使得細胞產(chǎn)生的內源性物質的種類、濃度或相對比例發(fā)生改變,這種改變最終體現(xiàn)在血漿、尿液等生物體液中小分子集合輪廓的改變上,利用多種譜學技術建立代謝物指紋圖譜來表征這種改變,并利用化學計量學的方法挖掘這些譜圖間隱含的信息,從而確定生物標記物,揭示外源性物質所誘導的生物學事件發(fā)生的靶器官、位點和強弱程度?；诖?代謝組學的研究通常涵蓋以下幾個層次:(1)代謝靶標分析(MetabolicTargetAnalysis),有目的地選擇某一組具有相似化學屬性的小分子類群,研究其在代謝應答中的變化,并與既知的生物途徑關聯(lián),研究得出外源性物質或病理狀態(tài)對這一生物途徑的效應;(2)代謝輪廓分析(MetabolicProfilingAnalysis),與靶點分析比較,它的研究對象更加廣泛,著眼于整個代謝網(wǎng)絡中的一些關鍵信息節(jié)點;(3)代謝指紋圖譜分析(MetabolicFingerprintAnalysis),比輪廓分析更趨于復雜,不關注于特殊組分,而對樣品進行快速篩選分類;(4)代謝組學分析(MetabonomicAnalysis),在前三者的基礎上,更進一步系統(tǒng)化,整合化,研究所有代謝產(chǎn)物的變化情況。作為生命學科領域中的一門新興組學技術,代謝組學與基因組學、轉錄物組學、蛋白組學等共同構成了“系統(tǒng)生物學”(SystemsBiology)。外源性物質作用于生物體后,應激性地導致基因轉錄、翻譯,蛋白質表達、合成,繼而代謝終產(chǎn)物生成等一系列變化,從DNA,mRNA到蛋白質組,再到代謝物組,生命信息在漸次的傳遞中逐步擴增,最終整合放大到代謝物組的變化上,同時由于代謝組學研究對象的易得性,這就大大提升了它的研究價值,為新藥篩選,毒理闡釋,疾病診斷等提供了新的視角和手段。一、數(shù)據(jù)處理與分析代謝組學關注的核心在于比較研究外源物刺激或基因變異后體液中小分子代謝產(chǎn)物集合的變化,但目前還沒有一種技術平臺能做到全成分分析。從研究階段上講,代謝組學研究可以劃分為兩大方面的內容:1.數(shù)據(jù)采集即以生物體液中的代謝產(chǎn)物為研究對象,利用NMR、LC-MS等各種譜學技術對其進行分析。代謝組學是基于NMR技術發(fā)展起來的,它對生物樣品的選擇寬泛,靈敏度高,非侵襲性實驗提供的微量樣品就足以供多次分析用,且不需要復雜的樣品前處理;同時新興的魔角旋轉技術已大大提高了NMR技術對復雜基質(如組織等)的分辨能力,使得NMR技術繼續(xù)在代謝組學研究中保持主流地位;色譜-質譜聯(lián)用技術整合了色譜的高分離度和質譜高靈敏度、普適性的長處,在代謝組學研究中獲得的越來越廣泛的應用。2.數(shù)據(jù)處理與分析利用模式識別對獲得的譜圖信息進行化學計量學處理,可采取監(jiān)督型(Supervised)或非監(jiān)督型(Unsupervised)方法分析數(shù)學算法前處理后得到的數(shù)據(jù)矩陣來發(fā)掘蘊涵著的有效信息,前者有主成分分析分析(PCA),聚類分析(CA)等;后者包括人工神經(jīng)網(wǎng)絡(ANN),偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)等,隨著研究的深入,對數(shù)據(jù)的分析正趨于智能專家系統(tǒng)化,如COMET初步建立的“CLOUDS”系統(tǒng),采用了非神經(jīng)網(wǎng)絡形式的概率k-NN分類方法,利用重疊強度對未知化合物進行毒理分類。目前,人們已經(jīng)認識到代謝組學研究的關鍵問題并不在于數(shù)據(jù)的獲取,而在于有效的實驗設計和對數(shù)據(jù)信息的充分解讀。隨著既往研究的積累,代謝組學在藥物毒理研究、作用機理闡釋和疾病診斷中的應用越來廣泛深入。下面從上述三種應用領域入手,選擇有代表性的個案扼要地概述代謝組學的研究進展及在中醫(yī)藥研究中的應用設想。二、代謝組理論在醫(yī)學研究中的應用1.代謝組的應用代謝組學的概念是Nicholson等人在以NMR技術為基礎的藥物毒性評價體系建立的系統(tǒng)工作中提出的,因此藥物毒理研究是代謝組學研究的初衷,也是目前研究最為活躍的領域之一。通過研究藥物作用后體液中代謝物組的擾動,將這種擾動與既知的生物代謝途徑關聯(lián),就能獲得關于外源物作用于生物體位點、途徑和強弱等相關信息,且隨著藥物毒理數(shù)據(jù)庫的建立、專家系統(tǒng)的完善,代謝物組在未知化合物的毒性預測中的應用具有廣闊的前景,這將大大降低新藥的創(chuàng)新成本和研發(fā)周期。Gartland等人研究發(fā)現(xiàn)由BEA、環(huán)氧丙烷和N-苯基鄰氨基苯甲酸誘導的乳突淋瘤樣毒性表現(xiàn)為早期尿樣中三甲胺-N-氧化物,二甲胺,甲胺和甜菜堿的升高,同時二甲基甘氨酸,檸檬酸鹽,2-酮戊二酸降低;在服用環(huán)孢霉素、HgCl2和d-絲氨酸后的大鼠尿液中,Williams等使用LC-MS發(fā)現(xiàn)了一系列新的表征腎小管損傷的生物標記物,它們在色氨酸代謝的過程產(chǎn)生;Holmes等利用代謝組學研究腎小管S3段損傷性化合物HgCl2和六氯對二甲苯,結果隨腎小管S3段損傷的加劇,尿中乳酸、羥丁酸鹽、馬尿酸鹽、Cr和酮戊二酸顯著升高,提示這些成分可以作為腎小管S3段損傷的生物標記物。國內王全軍等對抗腫瘤藥物Z24進行毒理代謝組學研究,結果PCA分析得分圖中高中低劑量呈現(xiàn)聚類分布,這種分布與毒性反應相對應,高中劑量的代謝表型是Z24肝臟毒性的典型表現(xiàn),順烏頭酸、己二酸、乳酸等被證實為生物標記物。2.心血管疾病的診斷病理過程中代謝網(wǎng)絡的某些環(huán)節(jié)出現(xiàn)紊亂,這最終體現(xiàn)在體液代謝組成和相對量的變化上。因此比較研究正常組與病理組的代謝物組,利用Supervised類型分析方法就能尋找到特定的表征病理狀態(tài)的生物標記物。許國旺等人基于LC-MS/MS技術對肝臟疾病的診斷進行代謝靶標研究,以尿液中核苷酸類代謝終產(chǎn)物為分析對象,PCA分析并經(jīng)組織病理學證實,可將肝炎、肝硬化誤診為肝癌的幾率下降到7.4%,目前這一研究成果正接受多方資金資助進行產(chǎn)業(yè)化開發(fā)。Brindle等應用NMR技術,以嚴重心血管疾病患者和心血管動脈硬化患者的血清和血漿為研究對象,進行了代謝組學分析,結合PCA,SIMCA,PLS-DA等模式識別技術建立了判別心血管疾病及其嚴重程度的新診斷方法,優(yōu)于傳統(tǒng)的血管造影術。隨著人類基因組草圖計劃的完成,后基因時代里多種“omics”技術涌現(xiàn),大量關于生命體基因、蛋白質、代謝物組間相互作用聯(lián)系的信息被發(fā)現(xiàn),這反饋性地刺激了檢驗醫(yī)學從單一項目檢測向整體分析過渡,從輔助疾病診斷向健康早期預警過渡,為代謝組學在檢驗醫(yī)學領域中的應用開拓了更為廣闊的前景。3.方法學體系的研究藥物作用于機體后一方面自身會被腸道菌群或肝藥酶代謝,產(chǎn)生活化或滅活的代謝產(chǎn)物,另一方面藥物/藥物代謝產(chǎn)物會導致機體內源性物質應答的變化,這最終還會體現(xiàn)在體液中代謝物組的成分構成或相對濃度的變化上,因此藥物代謝組學的研究目的在于從藥物誘導的內源物的時空變化切入,通過與相關生物途徑的關聯(lián),探討藥物的作用靶點和機制。目前,代謝組學研究大多集中在藥物毒理研究上,涉足藥物作用機制解析的研究-藥物代謝組學研究還處于初級階段,這主要表現(xiàn)在進行藥物代謝組學研究的技術平臺還正在構建,方法學體系正在探討,這當中PlumbR.S.研究小組進行了許多有益的開拓性研究。他們用LC/MS對鼠尿中3種候選藥物的代謝情況進行了檢測,通過將空白尿液與給藥尿液LC/MS譜圖的比較分析,成功的將3種藥物的代謝差異在質譜中區(qū)分出來,共找出了10個化合物。此外,他們還利用LC/TOFMS聯(lián)用技術在事先不清楚受試藥物結構的情況下對體液中的藥物代謝產(chǎn)物進行了檢測,結合化學計量學方法對給藥樣本與空白樣本的譜圖進行對比分析,在復雜譜峰中分析出了代謝產(chǎn)物的質譜峰,避開了大量內基質峰的干擾。黃玉榮等用代謝組學方法研究鉤藤多動合劑的藥效機制,采用攀爬實驗和自發(fā)行為實驗研究多動合劑對去水嗎啡小鼠模型的藥效作用,同時用HPLC-ECD方法研究其生化機制,觀察到多動合劑可抑制去水嗎啡引起的小鼠的攀爬行為,并減弱自發(fā)活動的增強。對去水嗎啡引起的血漿中DA和NE含量的改變及腦組織中DA含量的改變,多動合劑均能予以校正,表明多動合劑能調整單胺類神經(jīng)遞質的失衡以達到治療多動綜合征的目的。除了上述列舉的3種主要應用領域外,代謝組學尚還有植物代謝組學、營養(yǎng)代謝組學研究等分支。三、從生物代謝組學的角度探討中醫(yī)證候的本構模型自1999年有英國皇家理工學院的Nicholson提出代謝組學(Metabonomics)的概念以來,它以其在生命科學領域巨大的學術價值和應用潛力吸引了許多世界一流的實驗室參與到相關研究中。2001年Pfizer、EliLilly、Novartis等六家世界制藥巨頭與英國LondonImperialCollege合作成立了毒理代謝物組學國際研究協(xié)作組(ConsortiumforMetabonomicToxicology,簡稱COMET),致力于開發(fā)適于在新藥研發(fā)中進行毒理篩選的數(shù)據(jù)庫;創(chuàng)制用于毒性預測的軟件專家系統(tǒng)。由于得到數(shù)家頂級工業(yè)實驗室的支持,幾年來他們成績斐然,截至目前基于NMR技術的COMETⅠ已順利完成,由Waters公司進行戰(zhàn)略資助的基于LC/MS的COMETⅡ已實質開展。代謝組學在廣泛應用于藥物安全性評價和疾病診斷等研究領域的同時,由于其從代謝網(wǎng)絡終端表象的整體角度反映生物體的功能水平,這恰與中醫(yī)的整體思想吻合。從整體觀念來看,證侯是由受外源性刺激(外邪)或基因變異(內因)所致的病理變化過程,該過程使生物代謝網(wǎng)絡、使細胞產(chǎn)生的內源性產(chǎn)物的種類、濃度、相對比例發(fā)生擾動,這種擾動體現(xiàn)在小分子代謝產(chǎn)物集合輪廓的改變。因此利用多種譜學技術建立代謝物指紋圖譜來表征這種動態(tài)的多元生物整體信息的改變,并利用化學計量學的方法挖掘這些譜間隱含的信息,從而確定證侯的生物標記物,可從系統(tǒng)生物學的代謝物組學角度闡明中醫(yī)證侯的微觀本質。在此基礎上,以有效的方劑進行治療或干預,研究其對生物標記物的影響,通過以方測證的方法確證生物標記物的意義及方證相應性。從整體觀上看,證侯最終必須在動物的藥理和病理模型上予以證實。代謝物組學研究可以區(qū)別不同種屬、不同品系動物模型的代謝狀態(tài)的差異,尋找人類疾病藥效和毒性的適宜動物模型,而生物標志物起著動物模型和證侯的橋梁作用。因此,以證侯的生物標志物為動物模型的建模和評價體系,可建立出反映證侯本質的證侯動物模型。深入的研究工作將利用能誘導與證候Marker變化軌跡最大疊和的外