plga-絲素-膠原納米三維多孔支架的制備及細(xì)胞相容性研究

plga-絲素-膠原納米三維多孔支架的制備及細(xì)胞相容性研究

周圍神經(jīng)損傷的恢復(fù)和重建是臨床難題，也是組織工程的有效解決。SC在神經(jīng)再生和功能恢復(fù)中具有重要作用，組織工程神經(jīng)的制備需要大量SC及良好的支架載體。納米纖維支架具有擬生性好、比表面積大、高滲透性、可控釋活性物質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，膠原是ECM的主要結(jié)構(gòu)成分，具有良好擬生性能；PLGA可降解，具有良好的機(jī)械性能；蠶絲有較高的強(qiáng)度和柔性，對(duì)水和氧通透性好。將采用靜電紡絲法制作的PLGA、絲素、膠原納米支架與細(xì)胞復(fù)合后，細(xì)胞能在支架上生長(zhǎng)。但利用納米技術(shù)制作PLGA-絲素-膠原三維多孔支架并將其應(yīng)用于神經(jīng)組織工程，目前報(bào)道較少。我們的實(shí)驗(yàn)采用靜電紡絲法制備PLGA-絲素-膠原和單純PLGA納米三維多孔支架，觀察其理化性質(zhì)，并將其與SC復(fù)合培養(yǎng)，評(píng)價(jià)其細(xì)胞相容性，為納米組織工程神經(jīng)的進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1材料、試劑與儀器3d齡SD近交系乳鼠8只，雌雄各半，體重15～24g，由四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。PLGA(1∶1，與四川大學(xué)生命科學(xué)中心聯(lián)合研制）；蠶絲（雙宮絲，成都天友絲綢公司）；水溶性膠原蛋白（相對(duì)分子質(zhì)量6000×103,AR級(jí)，四川銘讓生物科技有限公司）；六氟異丙醇（Sigma公司，美國(guó)）；遺傳霉素（GIBCO公司，美國(guó)）；抗S-100蛋白多克隆抗體（武漢博士德生物技術(shù)有限公司）。BGG40/2高壓直流電源（天津大學(xué)新技術(shù)開發(fā)中心）；Reger3050材料試驗(yàn)機(jī)（深圳瑞格公司）；激光掃描共聚焦顯微鏡（Leica公司，德國(guó)）；掃描電鏡（JEOL公司，日本）；倒置相差顯微鏡（Olympus公司，日本）。1.2靜電紡絲plaga的制備電紡絲溶液的制備：將蠶絲于0.1%Na2CO3水溶液中煮沸30min，重復(fù)3次，去除絲膠。將絲素用CaCl2、H2O、C2H5OH三元溶液（摩爾比1∶8∶2）在78～80℃下溶解，溶液經(jīng)透析過濾后置于ABS盤內(nèi)室溫干燥成再生絲素膜。將再生絲素膜、水溶性膠原蛋白粉末及PLGA按質(zhì)量比1∶1∶2共同溶于六氟異丙醇中，PLGA終濃度2%，作為實(shí)驗(yàn)組；將單純2%PLGA溶于六氟異丙醇中作為對(duì)照組。將兩組電紡絲溶液加入安裝了已磨鈍的12號(hào)不銹鋼針頭的10mL注射器，針頭與BGG40/2高壓直流電源的正極相連，針頭下方安裝1個(gè)接地銅板，上覆鋁箔作為纖維的接收屏與高壓直流電源負(fù)極相連。在外加電壓10kV，接收距離10cm，電紡絲溶液流量為4mL/h的條件下進(jìn)行靜電紡絲。收集接收屏表面獲得的無紡纖維氈，置于干燥器中干燥后裁剪成10mm×10mm大小的樣品作為支架備用。1.3物理性能評(píng)價(jià)1.3.1描電鏡觀察將兩組支架樣品表面噴鉑金處理后，掃描電鏡觀察。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各取5個(gè)樣品，每個(gè)樣品選取5個(gè)視野，每個(gè)視野測(cè)量10個(gè)纖維直徑值，取均值進(jìn)行分析。1.3.2孔隙率的測(cè)定采用壓汞法測(cè)定支架孔隙率。兩組各取5個(gè)樣品測(cè)定體積后抽真空，將汞充至多孔支架周圍，再從外部對(duì)汞加壓，記錄壓力和加壓過程中進(jìn)入孔中汞的體積，孔隙率=進(jìn)入孔中汞體積/支架材料體積×100%。1.3.3濾紙吸干性能兩組各取5個(gè)樣品置于雙蒸水中24h，濾紙吸干表面的水分稱重（Ww），凍干后稱重（Wd），吸水率=[（Ww-Wd）/Wd]×100%。1.3.4抗張力測(cè)試兩組各取5個(gè)樣品置于Reger3050材料試驗(yàn)機(jī)上進(jìn)行拉伸試驗(yàn)，測(cè)定抗拉強(qiáng)度，拉伸速率為100mm/min。1.4體外生長(zhǎng)曲線無菌條件下取SD近交系乳鼠雙側(cè)臂叢神經(jīng)和坐骨神經(jīng)，置入Hank液中，解剖顯微鏡下剔除外膜，剪碎后用0.25%胰蛋白酶和0.03%膠原酶混合液消化30min。將細(xì)胞懸液按1×105個(gè)/mL細(xì)胞密度接種于預(yù)涂有多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶，于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)30min，收集未貼壁細(xì)胞重新接種于培養(yǎng)瓶中，含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，更換為含有G418(100g/mL）的DMEM培養(yǎng)基，48h后更換為DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后再換無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)72h后更換為含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基，以去除成纖維細(xì)胞。8～10d細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后采用0.025%胰蛋白酶-EDTA傳代。倒置相差顯微鏡下觀察生長(zhǎng)情況。取第4代SC按5×104個(gè)/mL細(xì)胞密度接種至蓋玻片上，待長(zhǎng)滿蓋玻片70%后，采用S-100免疫組織化學(xué)染色觀察，在100倍顯微鏡下，每張玻片隨機(jī)選擇10個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野的陽性細(xì)胞和陰性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比，表示SC純度。1.5細(xì)胞毒性試驗(yàn)1.5.1納米三維多孔提取物提取物將無血清DMEM培養(yǎng)液與兩組支架采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制備浸提液，并用DMEM和FBS配成含20%FBS的25%、50%及100%濃度浸提液。1.5.2兩種浸提液的dmem培養(yǎng)取第4代SC調(diào)整密度為5×104個(gè)/mL接種于96孔板上，每孔200μL。待細(xì)胞貼壁后分別與25%、50%及100%濃度的兩種浸提液培養(yǎng)，作為實(shí)驗(yàn)組；以DMEM培養(yǎng)作為空白對(duì)照組。培養(yǎng)1、3、5、7d每孔加入20μLMTT溶液，37℃下培養(yǎng)4h后加入150μLDMSO，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm測(cè)定吸光度（A）值。1.6干預(yù)細(xì)胞和支架的復(fù)合培養(yǎng)1.6.1dmem培養(yǎng)基的制備將PLGA-絲素-膠原納米三維多孔實(shí)驗(yàn)組支架置于75%乙醇浸泡30min，紫外光照射2h,PBS浸泡24h后更換DMEM培養(yǎng)基浸泡24h，置于12孔板。將第4代SC以5×104個(gè)/mL密度接種至支架，以含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，作為實(shí)驗(yàn)組。將單純PLGA支架同上法與第4代SC復(fù)合培養(yǎng)作為對(duì)照組。1.6.2掃描電鏡觀察(1)掃描電鏡觀察：復(fù)合培養(yǎng)2、4、6d后取出兩組支架，每次各取1片。4℃以2.5%戊二醛固定24h,PBS沖洗，1%鋨酸4℃固定4h，梯度乙醇脫水，CO2干燥器干燥、噴金、黏托，掃描電鏡觀察。(2)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察：復(fù)合培養(yǎng)4d后，兩組支架以S-100蛋白免疫熒光標(biāo)記SC，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，X軸掃描和三維重建，觀察SC在材料上的三維生長(zhǎng)情況。1.7統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，P值<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1纖維直徑、吸水率及觀念差異掃描電鏡顯示兩組支架呈相互交聯(lián)的多孔網(wǎng)狀無紡結(jié)構(gòu)，孔與孔之間高度貫通，纖維交錯(cuò)相疊，較為光滑均一（圖1）。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組纖維直徑分別為（141±9)nm和（205±11)nm；支架內(nèi)孔洞相互連通，孔隙率分別為87.4%±1.1%、85.3%±1.3%；吸水率分別為2647%±172%、2593%±161%；抗拉強(qiáng)度分別為（0.32±0.03）、（0.28±0.04)MPa；兩組以上指標(biāo)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。2.2s-100免疫海蘭加尼細(xì)胞的增殖培養(yǎng)24h后，多數(shù)細(xì)胞貼壁，呈雙極梭形，并在雙極伸出細(xì)長(zhǎng)突起（圖2）。成纖維細(xì)胞胞體較大，扁平，呈不規(guī)則形，無細(xì)長(zhǎng)突起，覆蓋于瓶底。第1次傳代前可見較多成纖維細(xì)胞。經(jīng)G418及無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)后成纖維細(xì)胞數(shù)量逐漸減少。0.025%胰蛋白酶-EDTA傳代時(shí)可見SC突起收縮，輕微振蕩即可脫落，而成纖維細(xì)胞收縮較晚，仍貼附于瓶壁，約7d可再次傳代。至第5代可見大量SC，少見成纖維細(xì)胞。S-100免疫組織化學(xué)染色顯示大量梭形、棕色濃染的SC，按“肩對(duì)肩”或“端對(duì)端”排列，呈陽性（圖3）。SC純度為96.5%±1.3%。2.3時(shí)間延長(zhǎng)SC在不同濃度實(shí)驗(yàn)組及空白對(duì)照組中生長(zhǎng)均良好，A值均隨時(shí)間延長(zhǎng)而增大。同組各時(shí)間點(diǎn)A值比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），各時(shí)間點(diǎn)各濃度實(shí)驗(yàn)組及空白對(duì)照組間比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖4。2.4關(guān)于細(xì)胞和支架的復(fù)合培養(yǎng)2.4.1sc生長(zhǎng)增殖細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)2d，實(shí)驗(yàn)組SC在支架上生長(zhǎng)良好，細(xì)胞多呈梭形，雙極突起，少數(shù)呈三角形或不規(guī)則形，有3個(gè)或多個(gè)細(xì)長(zhǎng)突起。對(duì)照組SC在支架上貼附生長(zhǎng)，但數(shù)量較少。復(fù)合培養(yǎng)4d，實(shí)驗(yàn)組SC生長(zhǎng)增殖，軸突相互連接，并有基質(zhì)分泌；對(duì)照組SC開始增殖，數(shù)量明顯較實(shí)驗(yàn)組少。復(fù)合培養(yǎng)6d，實(shí)驗(yàn)組SC大量增殖，細(xì)胞覆蓋支架表面，孔洞內(nèi)可見細(xì)胞生長(zhǎng)，并有基質(zhì)分泌；對(duì)照組SC軸突連接，生長(zhǎng)增殖（圖5）。2.4.2激光掃描共聚焦顯微鏡觀察復(fù)合培養(yǎng)4d，實(shí)驗(yàn)組SC在支架表面密集生長(zhǎng)，大量增殖，細(xì)胞之間以軸突相互連接；對(duì)照組SC在支架上生長(zhǎng)，細(xì)胞充分伸展，細(xì)胞數(shù)量較少（圖6）。3神經(jīng)流變學(xué)及生物活性材料自體神經(jīng)移植是周圍神經(jīng)損傷后神經(jīng)移植的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但自體神經(jīng)移植來源有限，會(huì)殘留供區(qū)感覺功能障礙和增加供區(qū)創(chuàng)傷。采用靜電紡絲法構(gòu)建的納米組織工程神經(jīng)支架修復(fù)周圍神經(jīng)缺損，具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)擬生態(tài)性：靜電紡絲法可以制備500～600nm的纖維，這和自然存在的神經(jīng)纖維在同一數(shù)量級(jí)上?？梢詾樯窠?jīng)細(xì)胞在體外的生長(zhǎng)、發(fā)育和細(xì)胞間信息傳導(dǎo)提供理想的微環(huán)境。(2)高比表面積：與其他微型材料相比，具有更高的比表面積，納米纖維能夠攜帶更多的神經(jīng)細(xì)胞或藥物，產(chǎn)生更好的效果。(3)可控釋活性物質(zhì)：將攜載藥物或細(xì)胞因子的納米纖維制作成支架，通過調(diào)控支架的密度和厚度，達(dá)到控釋目的。(4)高滲透性：有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的滲透、氧氣攝入和廢物排出。Kitazono等研究發(fā)現(xiàn)，NIH3T3細(xì)胞在靜電紡絲法制作的PLA納米纖維上生長(zhǎng)良好，可用其修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損，支持神經(jīng)軸突生長(zhǎng)。Yang等發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞在納米纖維上的分化較微米級(jí)支架要好。研究表明，PLGA濃度越低，獲得的納米纖維直徑越小，更光滑均一。我們實(shí)驗(yàn)采用靜電紡絲法制備了PLGA-蠶絲-膠原及單純PLGA兩種納米三維多孔支架。均光滑均一，支架內(nèi)孔洞相互連接。本實(shí)驗(yàn)PLGA濃度為2%，制備的PLGA-蠶絲-膠原納米三維多孔支架納米纖維直徑為（150±200)nm，孔隙率達(dá)80%以上。與單純PLGA納米多孔支架相比，其纖維相對(duì)較細(xì)，孔隙率大，抗拉伸能力更強(qiáng)。納米三維支架應(yīng)用于神經(jīng)組織工程，其材料來源可為天然材料、合成材料和復(fù)合材料。ECM是促進(jìn)神經(jīng)損傷后神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)的理想物質(zhì)，膠原蛋白作為ECM的主要成分，生物相容性好，但膠原機(jī)械性能欠佳，缺乏必要的力學(xué)強(qiáng)度。PLGA可降解，具有良好的生物安全性和機(jī)械強(qiáng)度，但PLGA在生物相容性及生物活性方面不及膠原蛋白。Bini等研究發(fā)現(xiàn)，C17.2神經(jīng)干細(xì)胞能在納米PLGA纖維上生長(zhǎng)分化。膠原與PLGA復(fù)合構(gòu)成的合成材料具有兩者優(yōu)點(diǎn)，效果更好。賈駿等研究表明PLGA納米纖維支架經(jīng)膠原改性后，細(xì)胞相容性有效提高。Schnell等研究表明，SC在聚己內(nèi)酯-膠原納米纖維支架上較聚己內(nèi)酯納米纖維生長(zhǎng)更好。神經(jīng)支架載體需要有一定的柔性和合適力學(xué)強(qiáng)度，并能引導(dǎo)神經(jīng)再生。蠶絲具有良好的柔性，在材料本身的性能上與神經(jīng)相接近。張文怡等采用蠶絲支架能維持SC細(xì)胞的正常形態(tài)和功能。Sahoo等發(fā)現(xiàn)PLGA-絲素納米纖維支架可作為肌腱、韌帶組織工程的合適載體。我們將SC種植在PLGA-絲素-膠原和單純PLGA納米三維多孔支架上的結(jié)果表明，單純PLGA納米三維多孔支架上黏附細(xì)胞較少，細(xì)胞形態(tài)好，具有生長(zhǎng)增殖能力；PLGA-絲素-膠原納米三維多孔支架上細(xì)胞貼附良好，生長(zhǎng)旺盛，細(xì)胞形態(tài)均一，細(xì)胞軸突相互連接，并且向孔洞內(nèi)呈立體三維生長(zhǎng)，伴大量基質(zhì)分泌，是SC生長(zhǎng)增殖的良好載體。納米支