膠原-殼聚糖膠原-納米羥基磷灰石仿生支架材料的制備及生物相容性研究

膠原-殼聚糖膠原-納米羥基磷灰石仿生支架材料的制備及生物相容性研究

因此，組織工程將骨軟骨膜修復(fù)軟骨缺損作為新趨勢(shì)。隨著材料科學(xué)和生物力學(xué)的發(fā)展,采用組織工程方法構(gòu)建形態(tài)、內(nèi)部結(jié)構(gòu)及生物力學(xué)性能均合適的組織工程骨軟骨雙相支架材料,有望解決這一難題。本研究依據(jù)仿生原理采用膠原-納米羥基磷灰石聚乳酸(nano-hydroxyapatite-collagen-polylacticacid,nHAC-PLA)作為軟骨下骨層,在其上方合成膠原-殼聚糖(collagen-chitosan,Col-CS)作為軟骨層,制備組織工程骨軟骨支架——Col-CS/nHAC-PLA仿生支架,并參考《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)》及ISO10993系列標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)生物相容性,為其在骨軟骨缺損修復(fù)領(lǐng)域中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)試劑與儀器普通級(jí)4周齡昆明小鼠20只,雌雄不限,體重(20±3)g;成年新西蘭大白兔28只,雌雄不限,體重(2.2±0.3)kg;均由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。Ⅰ型膠原蛋白(從鼠尾腱中提取)、1,4二氧六環(huán)(分析純)、PLA(相對(duì)分子質(zhì)量250×103)、骨粉(nHAC,即吸附有nHA的膠原纖維),均由清華大學(xué)材料科學(xué)與工程系制備;CS(分析純,北京化學(xué)試劑有限公司);L-DMEM(GIBCO公司,美國(guó));MTT試劑盒(Sigma公司,美國(guó))。FD-4冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);353型自動(dòng)酶標(biāo)儀(LabsystemsDragon公司,芬蘭);722G可見分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司);ThermoFormaCO2孵育箱(Thermo公司,美國(guó));IX70倒置相差顯微鏡(Olympus公司,日本);LDZ5-2型自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)。1.2仿生支架的制備由清華大學(xué)材料科學(xué)與工程系參照文獻(xiàn)方法制備Col-CS/nHAC-PLA仿生支架。(1)制備nHAC-PLA溶液:以1,4二氧六環(huán)為溶劑,按8%質(zhì)量濃度加入PLA,攪拌溶解2d,靜置1h去除氣泡。取與PLA固體量相同的nHAC加入PLA溶液中,再次攪拌溶解2d,靜置1h去除氣泡,備用。(2)制備Col-CS溶液:以2%醋酸溶液為溶劑,配制濃度為2%的CS純?nèi)芤杭?%的Col純?nèi)芤?將兩種溶液按質(zhì)量比(M/M)20∶1混合,磁力攪拌使其充分反應(yīng),備用。(3)取干燥通孔聚四氟乙烯模具,用透明醫(yī)用膠布封閉模具一端孔洞,向模具中倒入制備的nHAC-PLA溶液至模具80%位置,震動(dòng)模具,排出溶液中氣泡,置于—20℃冰箱中預(yù)凍1h。取出模具加入Col-CS溶液,高出nHAC-PLA材料約2mm,放入—20℃冰箱中預(yù)凍4h,—50℃、10Pa條件下冷凍干燥72h成形,即為Col-CS/nHAC-PLA仿生支架。取出支架放入大燒杯中,在—50℃、10Pa條件下于冷凍干燥機(jī)中放置10d,使殘留1,4二氧六環(huán)和醋酸冰晶充分揮發(fā)。1.3實(shí)驗(yàn)用浸提介質(zhì)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)所用浸提介質(zhì)為L(zhǎng)-DMEM,急性全身毒性實(shí)驗(yàn)、皮內(nèi)刺激實(shí)驗(yàn)、熱原實(shí)驗(yàn)及溶血實(shí)驗(yàn)所用浸提介質(zhì)為生理鹽水。支架材料與浸提介質(zhì)按0.2g材料∶1mL介質(zhì)比例配比,浸提條件為37℃、(72±2)h,將浸提液過濾除菌,4℃冰箱保存、備用。1.4觀測(cè)指標(biāo)1.4.1分組和注射鹽水參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取20只小鼠隨機(jī)分成兩組,每組10只。實(shí)驗(yàn)組按照50mL/kg劑量腹腔注射浸提液,對(duì)照組注入等量生理鹽水。于注射后24、48、72h觀察動(dòng)物存活情況、一般情況以及毒性反應(yīng)。1.4.2皮膚長(zhǎng)期刺激試驗(yàn)參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取3只新西蘭大白兔,于每只動(dòng)物脊柱兩側(cè)各取10個(gè)點(diǎn)(共60點(diǎn)),隨機(jī)分為3組,每組20個(gè)點(diǎn)。分別于各點(diǎn)皮內(nèi)注射0.2mL浸提液(實(shí)驗(yàn)組)、0.2mL生理鹽水(陰性對(duì)照組)及0.2mL20%乙醇(陽性對(duì)照組)。于注射后15min及24、48、72h觀察注射局部皮膚及周圍組織的紅斑及水腫狀況,參照皮膚反應(yīng)記分系統(tǒng)評(píng)定原發(fā)刺激指數(shù)(primaryirritationindex,PII),并進(jìn)行分級(jí):極輕微刺激為0~0.5分;輕度刺激為0.5~2.0分;中度刺激為2.0~5.0分;強(qiáng)度刺激為5.0~8.0分。1.4.3不同劑量耳緣進(jìn)行注射參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取3只新西蘭大白兔,于實(shí)驗(yàn)前30min測(cè)量體溫3次,取平均值作為正常體溫(T0)。按照10mL/kg劑量耳緣靜脈注射浸提液,注射后每隔1h測(cè)體溫1次,共3次,記為T1、T2、T3,其中最高1次體溫與T0之差,為體溫升高度數(shù)。以每只兔體溫升高數(shù)均<0.6℃或3只兔體溫升高總和<1.3℃判定為合格。1.4.4測(cè)定兔耳緣磷酸鈉溶血率a參照文獻(xiàn)[14-15]方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取1只新西蘭大白兔,耳緣靜脈抽血8mL,用1mL2.5%枸櫞酸鈉抗凝后,加入生理鹽水10mL稀釋,備用。取浸提液(實(shí)驗(yàn)組)、蒸餾水(陽性對(duì)照組)、生理鹽水(陰性對(duì)照組)各10mL置于3個(gè)離心管中,于37℃水浴預(yù)溫30min,然后各管分別加入兔耳緣靜脈血0.2mL,混勻,37℃水浴保溫60min。觀察有無溶血后,以離心半徑15cm、2000r/min離心5min,吸取上清液,用722G可見分光光度計(jì)在545nm波長(zhǎng)處測(cè)量各管吸光度(A)值,每組設(shè)6個(gè)平行樣品,計(jì)算溶血率:溶血率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-陰性對(duì)照組A值)/(陽性對(duì)照組A值-陰性對(duì)照組A值)×100%。判斷標(biāo)準(zhǔn):溶血率≤5%,表明材料符合生物材料和醫(yī)療器械溶血要求;溶血率>5%,表明材料有溶血作用。1.4.5細(xì)胞毒性檢測(cè)參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取3只新西蘭大白兔髂骨骨髓,采用密度梯度離心法分離培養(yǎng)BMSCs及傳代,取第2代細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個(gè)/mL,接種至96孔板(100μL/孔)。培養(yǎng)24h后更換為浸提液培養(yǎng)(實(shí)驗(yàn)組),分別以10%FBS培養(yǎng)液及含0.64%苯酚的培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照組及陽性對(duì)照組,每組設(shè)30孔。培養(yǎng)24、48、72h后倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),隨后每組各取10孔,每孔加入1mg/mL的MTT50μL,繼續(xù)孵育4h后棄培養(yǎng)液,加入DMSO150μL,振蕩10min,在酶標(biāo)儀上于490nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值,計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率(relativegrowthrate,RGR)。RGR(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白A值)/(陰性對(duì)照組A值-空白A值)×100%,根據(jù)RGR值評(píng)定材料的毒性分級(jí)。評(píng)定標(biāo)準(zhǔn):≥100%為0級(jí),75%~100%為Ⅰ級(jí),50%~75%為Ⅱ級(jí),25%~50%為Ⅲ級(jí),1%~25%為Ⅳ級(jí),<1%為Ⅴ級(jí)。細(xì)胞毒性0~Ⅰ級(jí)為合格;Ⅱ級(jí)應(yīng)結(jié)合細(xì)胞形態(tài)綜合評(píng)價(jià);Ⅲ~Ⅴ級(jí)為不確定。1.4.6術(shù)后處理及并發(fā)癥參照文獻(xiàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將Col-CS/nHAC-PLA仿生支架材料制成直徑4mm、厚5mm(軟骨層2mm、軟骨下骨層3mm)的圓柱形,以60Co照射消毒后,備用。取18只新西蘭大白兔,肌肉注射氯胺酮(50mg/kg)及異丙嗪(5mg/kg)麻醉后,暴露雙側(cè)髕股關(guān)節(jié),于其中一側(cè)股骨關(guān)節(jié)面上制備1個(gè)直徑4mm、深5mm的孔,包括關(guān)節(jié)面軟骨及軟骨下骨,制備關(guān)節(jié)軟骨缺損模型。植入制備的支架材料,輕輕打壓,以維持植入物穩(wěn)定性,并以髕骨覆蓋,逐層縫合,作為實(shí)驗(yàn)組。對(duì)側(cè)肢體僅制備相同規(guī)格孔,未作任何處理,作為對(duì)照組。術(shù)后不予固定,自由活動(dòng),連續(xù)3d肌肉注射慶大霉素預(yù)防感染。術(shù)后觀察動(dòng)物飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)、切口愈合情況、關(guān)節(jié)活動(dòng)度及死亡情況等。于術(shù)后4、8、12周分別處死6只動(dòng)物,暴露雙側(cè)關(guān)節(jié)腔,大體觀察實(shí)驗(yàn)組材料有無下陷及脫出,兩組缺損修復(fù)情況、材料周邊軟骨及髕骨關(guān)節(jié)面退變情況及滑膜增生程度等;取兩組標(biāo)本制備切片行HE染色,觀察材料周邊組織反應(yīng)及材料降解情況。1.5統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗(yàn);檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。2結(jié)果2.1兩組患者急性毒性反應(yīng)比較實(shí)驗(yàn)組小鼠一般情況良好,活動(dòng)、進(jìn)食均正常,呼吸平穩(wěn),無腹部刺激癥、腹瀉、運(yùn)動(dòng)減少、驚厥、癱瘓等毒性反應(yīng)及死亡,與對(duì)照組相比無明顯差異。2.2pii的測(cè)定實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組各點(diǎn)皮膚及周圍組織未見充血、水腫、壞死等反應(yīng),PII均為0分,為極輕微刺激;陽性對(duì)照組各點(diǎn)皮膚出現(xiàn)不同程度紅斑、水腫,PII平均6.3分,為強(qiáng)度刺激。2.3大白兔體溫測(cè)定新西蘭大白兔體溫升高為0.1~0.2℃,均小于0.6℃,3只大白兔體溫升高總和為0.4℃,小于1.3℃,符合規(guī)定標(biāo)準(zhǔn),表明無熱原反應(yīng)存在。2.4對(duì)照組及溶血率實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組均無明顯溶血現(xiàn)象,陽性對(duì)照組出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組及陽性對(duì)照組A值分別為0.027±0.003、0.016±0.003及0.813±0.031,實(shí)驗(yàn)組溶血率平均為1.38%,符合溶血率≤5%標(biāo)準(zhǔn),表明支架材料符合生物材料和醫(yī)療器械溶血要求。2.5小鼠骨髓細(xì)胞體增殖情況培養(yǎng)24h,陽性對(duì)照組見部分細(xì)胞未貼壁,呈懸浮死細(xì)胞,已貼壁細(xì)胞形態(tài)正常,呈梭形和多角形;實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組細(xì)胞幾乎全部貼壁,細(xì)胞形態(tài)正常。48h,陽性對(duì)照組見部分貼壁細(xì)胞胞體變小、變圓,數(shù)量較前無明顯增多;實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常,數(shù)量增多。72h時(shí),陽性對(duì)照組見大部分貼壁細(xì)胞胞體變小、變圓,核固縮,呈中毒狀態(tài),死細(xì)胞數(shù)增多;實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)正常,數(shù)量明顯增多,有細(xì)胞集落形成。見圖1。各時(shí)間點(diǎn)陽性對(duì)照組A值均顯著低于實(shí)驗(yàn)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);陰性對(duì)照組A值與實(shí)驗(yàn)組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組毒性分級(jí)均為Ⅰ級(jí),陰性對(duì)照組為0級(jí),陽性對(duì)照組為Ⅳ級(jí)。表明支架材料符合體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)要求,合格。2.6骨移植實(shí)驗(yàn)2.6.1飼養(yǎng)情況的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均存活至實(shí)驗(yàn)完成。術(shù)后1~2d動(dòng)物精神狀態(tài)較差,進(jìn)食減少,術(shù)肢活動(dòng)較少,局部有輕度紅腫。2d后進(jìn)食增加,精神狀態(tài)好轉(zhuǎn),術(shù)肢活動(dòng)逐漸恢復(fù)正常,切口愈合良好。2.6.2材料周邊軟骨組織的填充面及周邊間隙由大量纖維肉芽組織填充,周邊軟骨無明顯退變,髕股關(guān)節(jié)面光滑,無磨損;8周時(shí)材料表面及周邊間隙由白色纖維組織填充,與周邊關(guān)節(jié)面齊平;12周時(shí)材料周邊由部分軟骨組織替代,填充材料與軟骨的間隙。對(duì)照組:4周時(shí)部分纖維肉芽組織填充空洞,逐漸接近關(guān)節(jié)表面;8周時(shí)纖維肉芽組織仍未能完全填充空洞,周邊軟骨及髕股關(guān)節(jié)面出現(xiàn)退變;12周時(shí)空洞由部分纖維組織填充,表面不平整,周邊軟骨及髕股關(guān)節(jié)面出現(xiàn)不同程度退變。見圖2。2.6.3評(píng)分網(wǎng)孔材料表面可調(diào)式因子實(shí)驗(yàn)組:4周時(shí)材料表面及周邊間隙由纖維肉芽組織充填,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),材料與周邊組織邊界清楚,嵌合牢固,部分纖維組織長(zhǎng)入支架材料網(wǎng)孔中。8周時(shí)材料周邊炎性反應(yīng)緩解,網(wǎng)孔中有大量纖維組織長(zhǎng)入,并出現(xiàn)部分膠原成分及鈣化,表層部分關(guān)節(jié)軟骨向材料表面爬行生長(zhǎng),下層材料與軟骨下骨嵌合牢固并部分降解。12周時(shí)下層網(wǎng)孔材料中有大量組織填充,新生骨逐漸礦化,與周邊軟骨下骨融為一體,上層材料與周邊軟骨間隙消失,關(guān)節(jié)軟骨朝向材料表面繼續(xù)爬行生長(zhǎng),周邊軟骨無退變。見圖3。對(duì)照組:4周時(shí)缺損處由纖維肉芽組織從基底部向上填充,大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),關(guān)節(jié)軟骨邊緣變鈍,厚度減小。8周時(shí)缺損處纖維肉芽組織發(fā)生部分鈣化,未能填平關(guān)節(jié)面,表面不平整。12周時(shí)缺陷處表面凹凸不平,上層主要為纖維,且纖維組織排列紊亂,未形成透明軟骨,周邊軟骨變薄,出現(xiàn)不同程度的剝脫、分離和退變。見圖4。3col-cs/nhac-pla一體化復(fù)合材料的生物生物兼容性評(píng)價(jià)臨床上許多與軟骨相關(guān)的損傷常涉及軟骨下骨,軟骨下骨正常結(jié)構(gòu)破壞會(huì)導(dǎo)致其力學(xué)性能改變,修復(fù)組織早期愈合率低,最終造成新生組織軟化退變。研究表明,修復(fù)軟骨的同時(shí)修復(fù)軟骨下骨,可以較好模擬軟骨修復(fù)微環(huán)境,從而獲得相對(duì)理想修復(fù)效果。因此,構(gòu)建能同時(shí)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨和軟骨下骨的一體化組織工程骨軟骨,成為了目前研究熱點(diǎn)。研究表明,組織工程骨軟骨復(fù)合組織塊修復(fù)軟骨缺損的效果明顯優(yōu)于組織工程軟骨。本實(shí)驗(yàn)以nHAC-PLA作為軟骨下骨層,采用“鑲嵌”方式在其上方合成Col-CS作為軟骨層,構(gòu)建軟骨下骨層與軟骨層緊密連接的一體化骨軟骨雙相支架材料。該材料根據(jù)軟骨與骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)不同分層構(gòu)建,表層類似軟骨基質(zhì)結(jié)構(gòu),由成型性好的CS與細(xì)胞親和性好的Ⅰ型膠原復(fù)合而成,制備出成分和結(jié)構(gòu)上仿天然軟骨層的多孔支架——Col-CS,其底層為垂直孔結(jié)構(gòu),中層為圓形孔結(jié)構(gòu),頂層為致密孔結(jié)構(gòu),各層間無明顯分界,連通性好,與天然軟骨結(jié)構(gòu)相似,且在濕潤(rùn)狀態(tài)下各層力學(xué)性能有差異,有望更好的維持軟骨細(xì)胞表型和提高軟骨損傷修復(fù)效果。軟骨下骨層是基于仿生理念制備的礦化膠原基骨修復(fù)材料——nHAC-PLA,其孔徑為100~300μm,孔壁厚為15~30μm,孔隙率約90%,且各孔相互連通,在成分和結(jié)構(gòu)上與天然骨基質(zhì)相似。本實(shí)驗(yàn)通過冷凍干燥法及溶液互溶法,使軟骨下骨層與軟骨層成為完整一體,避免出現(xiàn)分層現(xiàn)象。此外,軟骨下骨層支架材料具有較大硬度,有利于支架材料早期固定,從而解決組織工程骨軟骨早期固定問題。支架材料植入體內(nèi)后骨層可與軟骨下骨組織快速整合,從而達(dá)到移植物固定的目的,提供軟骨再生所需要的生理及力學(xué)環(huán)境,有利于獲得更好的交界區(qū)整合,防止遠(yuǎn)期退變。任何一種生物材料應(yīng)用于臨床,不僅需要具備與機(jī)體組織相匹配的理化特性和生物力學(xué)性能,還應(yīng)具備良好的生物相容性。本實(shí)驗(yàn)主要參照GB/T16886和ISO10993系列標(biāo)準(zhǔn)選擇以上6項(xiàng)實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)Col-CS/nHAC-PLA一體化復(fù)合材料的生物相容性。驗(yàn)組組織學(xué)觀察(HE×200)a4周,黑色箭頭示肉芽組織及炎性細(xì)胞,黃色箭頭示纖維組織長(zhǎng)入支架網(wǎng)孔中b8周,黑色箭頭示炎性反應(yīng)較前緩解,黃色箭頭示膠原形成c12周,黑色箭頭示新生軟骨組織向材料表面爬行生長(zhǎng),黃色箭頭示新生骨小梁圖4術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組組織學(xué)觀察(HE×200)a4周,箭頭示纖維肉芽組織增生b8周,箭頭示纖維肉芽組織未能填平關(guān)節(jié)面,表面不平整c12周,黑色箭頭示周邊軟骨變薄并剝脫,黃色箭頭示缺損區(qū)表面纖維組織排列紊亂急性全身毒性實(shí)驗(yàn)是一種非特異性急性毒性實(shí)驗(yàn),將材料浸提液通過靜脈或者腹腔注射于動(dòng)物體內(nèi),觀察其生物學(xué)反應(yīng),以判斷材料的急性毒性。本實(shí)驗(yàn)中,動(dòng)物腹腔注射支架材料浸提液后,未見明顯全身急性毒性反應(yīng),表明支架材料未對(duì)動(dòng)物機(jī)體