腦損傷后神經(jīng)存活的機(jī)制

腦損傷后神經(jīng)存活的機(jī)制

0神經(jīng)胞質(zhì)細(xì)胞分化神經(jīng)干預(yù)的發(fā)現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了新的方向。在適宜的體外培養(yǎng)條件下,從胚胎和成年動(dòng)物包括人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)培養(yǎng)得到的神經(jīng)干細(xì)胞可分化成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和各種類型的神經(jīng)元,將其移植入腦內(nèi)能夠原位分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。隨著腦損傷發(fā)生率的逐年增加,如何提高顱腦損傷的救治水平是神經(jīng)外科研究的重點(diǎn)。課題利用無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù),在表皮生長(zhǎng)因子和堿性成纖維生長(zhǎng)因子的刺激下培養(yǎng)胎鼠前腦組織,將得到的神經(jīng)干細(xì)胞移植入大鼠創(chuàng)傷性腦損傷灶周邊,觀察其在原位的成活、遷移和分化情況。1免疫組化和免疫熒光設(shè)計(jì):細(xì)胞學(xué)體內(nèi)觀察。時(shí)間及地點(diǎn):于2008-05/2009-10在河北北方學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心完成。材料:清潔級(jí)孕16dWistar胎鼠2只和Wistar大鼠12只,雌雄不拘,體質(zhì)量250~300g,由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供,動(dòng)物質(zhì)量許可證號(hào)為SCXK(京)2005-0013,實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)用主要試劑:實(shí)驗(yàn)方法:細(xì)胞培養(yǎng):取孕16dWistar胎鼠,在無(wú)菌條件下取腦,分離出前腦,制成單細(xì)胞懸液。接種于盛有5mL含N2的DMEM/F12培養(yǎng)基的50mL培養(yǎng)瓶中,接種密度為1×108L-1,加入終濃度為20μg/L表皮生長(zhǎng)因子、終濃度為10μg/L堿性成纖維生長(zhǎng)因子。待原代克隆形成后機(jī)械分離成單細(xì)胞懸液,按上述條件繼續(xù)培養(yǎng),每3~5d半量換液1次,7~10d分離傳代1次,方法同前。nestin抗原免疫組化和免疫熒光鑒定:取部分神經(jīng)球和單細(xì)胞懸液,離心后直接涂片檢測(cè),或者均勻地接種到預(yù)先置有涂布多聚賴氨酸蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中,并加入含有體積分?jǐn)?shù)為20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基,孵育2h后行抗nestin免疫組化和免疫熒光染色。BrdU標(biāo)記及其檢測(cè):將BrdU加入傳代培養(yǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)基中,終濃度為6mg/L,同時(shí)加入終濃度為20μg/L表皮生長(zhǎng)因子、終濃度為10μg/L堿性成纖維生長(zhǎng)因子,按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)5d。新克隆形成后,將神經(jīng)球均勻地接種到預(yù)先置放涂有多聚賴氨酸蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中,待神經(jīng)球貼壁2h后行免疫組化和免疫熒光檢測(cè)。克隆誘導(dǎo)分化免疫組化及免疫熒光檢測(cè):取克隆細(xì)胞球,制成單細(xì)胞懸液,接種到預(yù)先置放涂有濃度為25mg/L的多聚賴氨酸蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中,并加入含有體積分?jǐn)?shù)為20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基,按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)7d后,行GFAP,NSE或MAP-2免疫組化及免疫熒光染色。動(dòng)物模型的建立:實(shí)驗(yàn)采用改進(jìn)的Feeney氏自由落體撞擊法來(lái)制作創(chuàng)傷性腦損傷模型。12只大鼠按4mL/kg腹腔注入10%水合氯醛進(jìn)行麻醉,將大鼠固定在立體定位儀上,頭部消毒,無(wú)菌操作下頭皮正中縱向切開(kāi),剝開(kāi)骨膜暴露左側(cè)頂骨,于矢狀縫左側(cè)旁開(kāi)3.5mm、冠狀縫后3.5mm處鉆一直徑6mm的圓形骨窗,注意保護(hù)腦膜。將撞桿頭端置于骨窗腦膜外,其外垂直金屬套管,用30g打擊棒沿金屬套管從25cm高度自由落下沖擊撞針,造成大鼠左側(cè)大腦半球局部腦挫裂傷。再次消毒術(shù)區(qū),縫合頭皮切口,大鼠放回籠中復(fù)蘇。神經(jīng)干細(xì)胞移植:移植前5d,向培養(yǎng)瓶中加入6mg/LBrdU培養(yǎng)。BrdU在DNA合成時(shí)可被細(xì)胞攝取利用而參與DNA的組成,以標(biāo)記分裂的細(xì)胞,當(dāng)這些細(xì)胞移植入腦內(nèi)后,用BrdU抗體免疫組化及免疫熒光方法可以將含BrdU的細(xì)胞檢測(cè)出來(lái)。動(dòng)物模型建立24h后,行同側(cè)神經(jīng)干細(xì)胞移植。坐標(biāo)為冠狀縫后0.6mm,中線左側(cè)3.5mm插入,硬膜下3.0mm。用微量注射器吸取細(xì)胞懸液10μL(細(xì)胞數(shù)1×1011L-1)。將注射器固定在立體定位儀上,按選好的坐標(biāo)進(jìn)針,細(xì)胞懸液在10min內(nèi)注射完,留針10min后,緩慢拔出針頭。神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)的存活、遷移檢測(cè):取12只神經(jīng)干細(xì)胞移植大鼠,分別在移植后7,14d取6只灌注固定,分別進(jìn)行BrdU,GFAP免疫組織化學(xué)和免疫熒光雙染。設(shè)計(jì)、實(shí)施、評(píng)估者:實(shí)驗(yàn)由第二作者設(shè)計(jì),第一、三、四作者實(shí)施,第七、八作者進(jìn)行結(jié)果評(píng)估,均經(jīng)過(guò)系統(tǒng)培訓(xùn),未使用盲法評(píng)估。2結(jié)果2.1傳代神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)法原代培養(yǎng)的前腦細(xì)胞成透亮圓球形,懸浮生長(zhǎng),細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,邊界清楚,體積較小,折光性較強(qiáng),胞漿顏色較深,核/漿比值大,1周左右培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)有許多由數(shù)十到數(shù)百個(gè)細(xì)胞組成的呈懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞球,見(jiàn)圖1a。傳代神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)出現(xiàn)與原代培養(yǎng)相同的克隆細(xì)胞球,細(xì)胞形態(tài)不變。傳代后,加入血清分化1d,有突起從貼壁細(xì)胞團(tuán)邊緣長(zhǎng)出,見(jiàn)圖1b。2.2神經(jīng)球的分離和傳代直接涂片檢測(cè)的神經(jīng)球未發(fā)現(xiàn)有突起從細(xì)胞團(tuán)邊緣長(zhǎng)出,其形態(tài)保持完好。貼附于蓋玻片上的神經(jīng)球2h后發(fā)現(xiàn)有突起從細(xì)胞團(tuán)邊緣長(zhǎng)出,傳代的神經(jīng)球中的細(xì)胞均呈nestin陽(yáng)性,表明培養(yǎng)得到的神經(jīng)球中的細(xì)胞具有胚胎源性,且與血清接觸后在早期便可進(jìn)入分化階段,見(jiàn)圖2。2.3神經(jīng)球的接種加BrdU5d后,可見(jiàn)新的克隆球已形成,新克隆形成后,將神經(jīng)球均勻接種到預(yù)先置放涂有多聚賴氨酸蓋玻片的6孔培養(yǎng)板中。待克隆球貼壁后,免疫組化顯示新形成克隆球中的細(xì)胞均為BrdU陽(yáng)性,表明克隆球有不斷分裂增殖的生物學(xué)特性,見(jiàn)圖3。2.4胞長(zhǎng)和突變織物的形態(tài)圖4,5可見(jiàn),細(xì)胞貼壁后形態(tài)變?yōu)椴灰?guī)則,部分細(xì)胞長(zhǎng)出突起,有的突起相互交織成網(wǎng)狀,建立起形態(tài)上的聯(lián)系。免疫組化及免疫熒光檢測(cè)顯示,細(xì)胞誘導(dǎo)分化后呈GFAP,NSE,MAP-2陽(yáng)性反應(yīng)。2.5brdu陽(yáng)性檢測(cè)移植后7d,大部分移植細(xì)胞聚集在移植的針道附近及腦損傷灶周邊,免疫組化及免疫熒光顯示BrdU陽(yáng)性。隨后細(xì)胞從移植的針道向附近的腦組織遷移,部分細(xì)胞遷移到相對(duì)較遠(yuǎn)的地方,伸出較長(zhǎng)的突起,仍顯示BrdU陽(yáng)性。移植后14d,在移植細(xì)胞的針道附近BrdU陽(yáng)性數(shù)目有所減少,GFAP陽(yáng)性細(xì)胞增多。腦損傷灶周邊遠(yuǎn)處BrdU陽(yáng)性細(xì)胞散在分布,見(jiàn)圖6,7。3神經(jīng)干細(xì)胞移植研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞具有兩個(gè)顯著特點(diǎn):一是具有高度的自我更新能力,能夠重復(fù)進(jìn)行有絲分裂,產(chǎn)生大量的子細(xì)胞;二是在一定的條件下,可誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。成年人中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生困難,顱腦損傷后,損傷灶周邊區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞的存活數(shù)量直接影響患者的預(yù)后。干細(xì)胞療法近年來(lái)已成為治療多種疾病的新策略,神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)于修復(fù)受損腦組織是一種有效的治療方法。實(shí)驗(yàn)采用改進(jìn)的Fenney’s落體腦損傷模型,觀察大鼠胚胎前腦來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞移植入腦挫裂傷模型鼠損傷灶周邊后,在其周?chē)某苫睢⑦w移和分化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,從胎鼠分離培養(yǎng)出的神經(jīng)干細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)條件下,由表皮生長(zhǎng)因子和堿性成纖維生長(zhǎng)因子刺激后,這種神經(jīng)干細(xì)胞能不斷分裂增殖,形成神經(jīng)球,在同樣條件下能不斷傳代形成新的神經(jīng)球。神經(jīng)干細(xì)胞取材時(shí)和神經(jīng)球傳代時(shí),都需要將聚集在一起的細(xì)胞分散。很多報(bào)道采用酶消化法分散細(xì)胞團(tuán),實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)反復(fù)比較發(fā)現(xiàn),酶消化短時(shí)間無(wú)法使細(xì)胞團(tuán)完全分散,延長(zhǎng)消化時(shí)間卻使細(xì)胞粘連成索狀(DNA釋出所致)或大量死亡。實(shí)驗(yàn)用巴氏吸管反復(fù)機(jī)械吹打,手法盡量輕柔,并采用200目細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾,神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)良好,經(jīng)傳代后仍具有增殖和分化能力。將BrdU加入到培養(yǎng)基中,作為胸腺嘧啶的衍生物,可代替胸腺嘧啶在DNA合成期(S期)摻入到不斷分裂新合成的神經(jīng)干細(xì)胞DNA中,從而標(biāo)示增殖細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞缺乏成熟神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞的特征性標(biāo)志,但表達(dá)一種中間絲蛋白nestin,該蛋白目前已作為神經(jīng)干細(xì)胞的特征性生物學(xué)標(biāo)志被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定。實(shí)驗(yàn)在神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)的穩(wěn)定增殖期,即原代培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)的7~10d獲取神經(jīng)干細(xì)胞克隆球,對(duì)克隆球和貼壁分化的細(xì)胞進(jìn)行免疫組化及熒光染色,細(xì)胞球均為nestin陽(yáng)性,表明實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)得到的細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞。多分化潛能是神經(jīng)干細(xì)胞的一個(gè)基本屬性,在從培養(yǎng)基中除去表皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維生長(zhǎng)因子后,加入胎牛血清進(jìn)行有血清培養(yǎng),神經(jīng)干細(xì)胞能分化出神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。在體外貼壁分化過(guò)程中,nestin的表達(dá)越來(lái)越少,出現(xiàn)了神經(jīng)元的標(biāo)志性蛋白——神經(jīng)元特異性烯醇化酶,膠質(zhì)細(xì)胞特征性蛋白——神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白以及微管相關(guān)蛋白2,免疫組化結(jié)果與免疫熒光結(jié)果均為陽(yáng)性,證明培養(yǎng)得到的細(xì)胞具有較強(qiáng)增殖能力,且具有多向分化潛能,能分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞移植后在宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的成活、遷移和分化引起越來(lái)越多學(xué)者們的注意,很多學(xué)者對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞移植后的存活、遷移和分化作了初步研究。Wallenquist等將綠色熒光蛋白標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞移植到實(shí)驗(yàn)性腦損傷后1周的小鼠健側(cè)的側(cè)腦室內(nèi),結(jié)果顯示多于90%的側(cè)腦室移植發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞聚集在未損傷側(cè)的側(cè)腦室壁、胼胝體及皮層損傷周?chē)鷧^(qū)。在移植后1周觀察,其向損害周?chē)鷧^(qū)遷移,并且胼胝體和側(cè)腦室壁膠質(zhì)細(xì)胞增多;3個(gè)月后損害周?chē)鷧^(qū)標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量減少,損傷側(cè)的腦室仍可探測(cè)到標(biāo)記細(xì)胞。Mine等將由綠色熒光蛋白標(biāo)記的胚胎源性中腦神經(jīng)干細(xì)胞移植入帕金森病模型大鼠的新紋狀體內(nèi),顯示其存活并分化為酪氨酸羥化酶陽(yáng)性細(xì)胞,8周后陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量為正常腦移植的3倍,并具有較成熟的神經(jīng)元形態(tài)。Demeter等用神經(jīng)外胚層干細(xì)胞NE-4C經(jīng)綠色熒光蛋白、耐熱堿性磷酸酶和BrdU標(biāo)記后,植入成年、新生兒和胚胎小鼠前腦觀察發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞在時(shí)間和空間上能夠整合到腦組織,移植細(xì)胞在胎鼠前腦呈腫瘤樣的聚集物伸出;移植入成年鼠腦的干細(xì)胞呈神經(jīng)發(fā)生帶樣生長(zhǎng)。Prajerova等將D6啟動(dòng)子增強(qiáng)的表達(dá)GFP的小鼠神經(jīng)干細(xì)胞移植入成年大鼠正常腦和光化學(xué)損傷腦經(jīng)免疫組化觀察,在體外分化中表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物,大部分為未成熟的神經(jīng)元和GFAP陽(yáng)性細(xì)胞,另用膜片鉗技術(shù)發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞膜的一些Na+、K+通道與未損傷的細(xì)胞相似,移植1周后表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)記物。除了用動(dòng)物的神經(jīng)干細(xì)胞來(lái)進(jìn)行細(xì)胞移植研究外,有的學(xué)者對(duì)人源性神經(jīng)干細(xì)胞移植也作了研究。Hicks等將人胚胎源性神經(jīng)干/祖細(xì)胞移植入大鼠永久性大腦中動(dòng)脈遠(yuǎn)側(cè)段梗死模型的腦皮質(zhì)內(nèi),2個(gè)月后用熒光共聚焦顯微鏡觀察,見(jiàn)一部分nestin陽(yáng)性細(xì)胞,另有神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)。皮質(zhì)干細(xì)胞移植能補(bǔ)償梗死后腦細(xì)胞的丟失。Darsalia等將人胚胎源性新紋狀體和皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞移植到卒中后大鼠的紋狀體內(nèi),首先兩種來(lái)源的細(xì)胞在體外顯示出局部特定分化,但在移植入新生大鼠紋狀體后存活、遷移和形成神經(jīng)元相似。兩類細(xì)胞移植到成年大鼠因卒中損傷的紋狀體內(nèi)1個(gè)月后,表現(xiàn)出相似的存活率(30%)并遷移到紋狀體各處,源于紋狀體的神經(jīng)干細(xì)胞遷移的更遠(yuǎn)一些,占其容積率更大。在移植核心部位細(xì)胞未分化,表達(dá)nestin,較少表達(dá)GFAP,βⅢ-tubulin,DCX,calretinin及未成熟的神經(jīng)譜系標(biāo)記物。用細(xì)胞增殖標(biāo)記物(p-H3和Ki67)顯示了在移植片中增殖細(xì)胞含量較低,人源性細(xì)胞外部分化顯示成熟神經(jīng)細(xì)胞形態(tài),并表達(dá)成熟細(xì)胞標(biāo)記物。有趣的是紋狀體來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生一定數(shù)量parvalbumin陽(yáng)性和calbindin陽(yáng)性神經(jīng)元,移植的細(xì)胞沒(méi)有分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。因此,人胚胎源性神經(jīng)干細(xì)胞有很強(qiáng)的神經(jīng)生發(fā)能力,可用于神經(jīng)損傷修復(fù)。其潛在的安全性和生命活力有待進(jìn)一步探討。實(shí)驗(yàn)中將同種大鼠胚胎源性腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞植入創(chuàng)傷性腦損傷模型皮質(zhì)損傷灶周邊,觀察到移植后1周大部分移植細(xì)胞聚集在移植點(diǎn)附近,免疫組化顯示BrdU陽(yáng)性細(xì)胞。少量細(xì)胞從移植點(diǎn)向相對(duì)較遠(yuǎn)的地方遷移,并伸出突起,與周?chē)M織整合。移植2周后免疫組化和免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè),移植點(diǎn)附近仍有少量,以及損傷灶周邊散在分布一些BrdU陽(yáng)性細(xì)胞。免疫熒光顯示GFAP陽(yáng)性細(xì)胞增多。表明神經(jīng)干細(xì)胞移植入宿主腦能夠存活,遷移和分化,可與宿主腦組織整合,并能夠形成成熟神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前述作者一致,但在與人源性神經(jīng)干細(xì)胞移植上略有不同,考慮可能是由于種屬差異造成或損傷灶周?chē)h(huán)境影響?，F(xiàn)在對(duì)神經(jīng)修復(fù)較為困難主要原因并不是神經(jīng)元本身,而是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的微環(huán)境不適合神經(jīng)元軸突再生。包括膠質(zhì)細(xì)胞增生形成瘢痕對(duì)神經(jīng)元軸突再生造成空間障礙、促神經(jīng)生長(zhǎng)因子或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的缺乏和神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)抑制因子的存在等原因。神經(jīng)干細(xì)胞在移植部位分裂增殖,并在局部微環(huán)境的作用下分化成相應(yīng)的細(xì)胞而替代受損細(xì)胞。移植入創(chuàng)傷性腦損傷模型鼠的神經(jīng)干細(xì)胞是否能對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)潰變的神經(jīng)元起功能性補(bǔ)充或保護(hù)作用?進(jìn)一步研究正在進(jìn)行中。神經(jīng)干細(xì)胞移植利益沖突:課題未涉及任何廠家及相關(guān)雇主或其他經(jīng)濟(jì)組織直接或間接的經(jīng)濟(jì)或利益的贊助。課題的意義:實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)了胎鼠前腦神