一個(gè)液相方法優(yōu)化案例

分析方法是質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要組成部分，常用來檢測活性成分、有機(jī)雜質(zhì)、無機(jī)雜質(zhì)、殘留溶劑等，以檢測藥物是否符合其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確保其安全有效。在物料的日常檢測（有關(guān)物質(zhì)）中，通常會(huì)采用供應(yīng)商提供的方法，但這些方法一般情況下僅滿足樣品檢測需要，但是否滿足系統(tǒng)適用性要求，需要進(jìn)一步研究，具體例子如下：化合物結(jié)構(gòu)：兒茶酚類似物色譜條件：色譜柱：XbridgeC18（4.6X250mm，5四m），波長254nm，流速：1.0ml/min，柱溫：45°C，流動(dòng)相A：10mM甲酸鹽（甲酸調(diào)節(jié)pH值至3.0），流動(dòng)相B：甲醇，稀釋劑：甲醇梯度1如下：t/min0404545.155A9030309090B10707010101、溶劑效應(yīng)導(dǎo)致肩峰。根據(jù)擬定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，配成雜質(zhì)限度濃度的SST溶液，進(jìn)樣，結(jié)果如圖1所示。主峰前的多個(gè)雜質(zhì)的色譜峰成肩峰，推測原因可能是溶劑效應(yīng)導(dǎo)致的。將SST溶液用流動(dòng)相A稀釋一倍，重新進(jìn)樣（進(jìn)樣量加倍），肩峰消失（詳見圖2），因此可以確定是溶劑效應(yīng)導(dǎo)致的。溶劑效應(yīng)的根本原因是樣品進(jìn)入色譜柱后，由于溶解或稀釋樣品的溶劑與流動(dòng)相組成之間存在極性，溶解性存在差異，導(dǎo)致分析物在溶劑與流動(dòng)相之間進(jìn)行液-液分配直到平衡狀態(tài)，部分取代了分析物在流動(dòng)相與固定相之間的液固分配平衡，正是由于分析物液-液分配不能瞬間完成，導(dǎo)致溶劑效應(yīng)［1］。因此，需要兼顧稀釋劑與流動(dòng)相起始比例的相容性以及樣品的溶解性，一般使用初始流動(dòng)相作為稀釋劑；也可通過減小進(jìn)樣量來緩解溶劑效應(yīng)。圖1SST色譜圖（主峰前色譜峰肩峰）

圖2SST色譜圖（主峰前色譜峰肩峰消失）2、緩沖鹽濃度低導(dǎo)致肩峰。通過圖2可以看出，6.7min的未知雜質(zhì)峰仍然是肩峰（原圖放大明顯），可能的原因是緩沖鹽濃度低，離子強(qiáng)度及緩沖能力弱，導(dǎo)致色譜峰呈現(xiàn)肩峰。加大緩沖鹽濃度至25mM，該色譜峰峰行正常；通過使用苯基己基，該色譜峰峰行正常，主要是色譜柱填料不同，導(dǎo)致選擇性不同。圖325mM甲酸鹽-SST色譜圖（原6.7min色譜峰肩峰消失）圖4苯基己基柱-SST色譜圖（原6.7min色譜峰肩峰消失）3、柱溫過高導(dǎo)致峰重合。柱溫也是影響分離度的一個(gè)參數(shù)，通常情況下，柱溫升高，色譜柱背壓降低，出峰時(shí)間提前（尤其是離子化合物）。在本實(shí)驗(yàn)中，降低色譜柱柱溫（35°C、30°C），16.8min色譜峰（圖3）變?yōu)?個(gè)色譜峰，詳見圖5。主要原因是柱溫較高時(shí)，后面的峰跑到前面，與之重合。因此，在方法開發(fā)時(shí)，盡可能的將柱溫控制在35C以下。圖5柱溫30C-SST色譜圖4、溶劑干擾。甲醇的色譜圖中有較大的未知色譜峰，對檢測有干擾（圖534min色譜峰），更換默克試劑，無干擾；也可以嘗試使用鬼峰捕集小柱，通過吸附溶劑中的污染物，排除干擾。5、進(jìn)樣四針后，色譜圖出現(xiàn)鼓包。可能是流動(dòng)相積累到色譜柱柱頭，污染導(dǎo)致。前面梯度不變，在后面一段時(shí)間增加有機(jī)相比例，在52.5min后出現(xiàn)兩個(gè)大的未知色譜峰，但這兩個(gè)色譜峰在空白及進(jìn)樣0叱色譜圖中都存在，說明是空白中引入的；考慮到運(yùn)行時(shí)間過長以及甲酸鹽易受污染，更換緩沖鹽體系為20mM磷酸鹽，分別通過梯度1及2連續(xù)進(jìn)樣，未見鼓包，且雜質(zhì)譜未改變。修改后梯度2：t/min040455555.165A903030109090B107070901010圖6鼓包色譜圖

圖7空白色譜塔（升高有機(jī)相比例）BD：?>1GOD：*噂OlWj圖8升高有機(jī)相比例（20mM磷酸鹽）-SST色譜圖圖8原色譜條件（20mM磷酸鹽）-SST色譜圖通過上述內(nèi)容可以看出，在前期的方法開發(fā)中，對于稀釋劑的選擇、緩沖鹽的體系、色譜柱柱溫、色譜柱的類型（注意通用性）、有機(jī)相比例的選擇尤為重要，具體