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實(shí)驗(yàn)室常用載體介紹載體構(gòu)建的基本原理1.TA克隆(T4連接酶)

Promega的T-easy載體（pGEM-TEasy）TAKRAT載體(pMD18-T)2.TOPO

TA克隆(pCR8/GW/TOPO)定向克隆(pENTR)3.酶切連接

實(shí)驗(yàn)室常用4.Gateway技術(shù)TOPO異構(gòu)酶Gateway?技術(shù)基于清楚了解的λ噬菌體位點(diǎn)特異重組系統(tǒng)(attB+attP；attL+attR)。BP反應(yīng)是DNA片段或者包含attB位點(diǎn)的表達(dá)克隆與包含attP位點(diǎn)的供載體（donorvector）之間進(jìn)行的反應(yīng)。BP反應(yīng)產(chǎn)生入門克隆。LR反應(yīng)是含attL位點(diǎn)的入門克隆和包含attR位點(diǎn)的目的載體之間的重組反應(yīng)。LR反應(yīng)產(chǎn)生表達(dá)克隆。表達(dá)克隆包含目的基因和目的載體特異的啟動(dòng)子或者一些元件。Gateway?技術(shù)1.創(chuàng)建入門克隆，通過(guò)PCR或傳統(tǒng)的克隆方法將目的基因克隆進(jìn)入門載體。2.混合包含目的基因的入門克隆和合適的目的載體及Gateway?LRClonase?酶，產(chǎn)生表達(dá)克隆。致死基因：DB3.1GatewayattB引物attB15’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTNN-3’

attB25’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTN-3’Prolinerichproteinlikeprotein(PRPL)SenseprimerGGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGAACATAAGCCCCCTGTCAntisenseprimerGGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCATAAGCACTCTCGCTAGT酶切連接載體超表達(dá)

pCAMBIA2300S啟動(dòng)子

pBINm-gfp5-ER和pBI121Gateway技術(shù)載體超表達(dá)

pGWB401pGWB501pGWB402pGWB502pGWB402ΩpGWB502Ω可能都要做融合蛋白了，與gfp或者h(yuǎn)is標(biāo)簽，這樣以后就可以做WESTERN了。這邊他

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