食用菌菌種分離與保藏方法

食用菌菌種分離與保藏方法食用菌是一種純培養(yǎng)，而在自然界中食用菌的發(fā)育繁衍過程中，又與其他眾多的微生物混雜在一起。人們有目的地從中將特定品種食用菌的菌絲體單獨分離出來，并在此基礎上將獲得的菌絲體進一步純化，該過程就稱為菌種分離。為了獲得單一、純度高的菌種，目前生產(chǎn)上常用的方法主要組織分離、孢子分離以及基內菌絲分離法等?，F(xiàn)將該3種菌種分離方法及保藏方法總結如下。1菌種分離方法1.1組織分離法組織分離法是通過切取菌索、子實體、菌核的新鮮幼嫩的組織進行分離，以獲取純菌絲的方法，是最常用的菌種分離法之一。子實體、菌索等實際上就是雙核菌絲的紐結物，具有很強的再生能力。因分離時所選擇的材料不同，該方法又可分為菌索組織分離法、子實體組織分離法及菌核組織分離法。在實踐中，子實體組織分離法是最有效、最常用的方法。但對于膠質菌，由于其子實體中所含的菌絲量比較低，如黑木耳、銀耳等，利用組織分離培養(yǎng)難度較大。組織分離屬于無性繁殖的范疇，能保持原菌株的特性，遺傳穩(wěn)定變異小，不僅適于孢子不易收集或萌發(fā)的食用菌，也適于穩(wěn)定優(yōu)良品種的遺傳性［1］。1.2孢子分離法孢子分離法，是采取子囊果或子實體中成熟的子囊孢子或有性孢子萌發(fā)成純菌絲，再進一步培養(yǎng)成菌種的方法。由此法可以獲得強活性、短菌齡的菌絲，該方法的另外一個優(yōu)點是分離得到的有性孢子兼有雙親的遺傳特性，可用于雜交育種和選育新種中。只是孢子間不僅存在個體差異，還存在較普遍的自然分化現(xiàn)象，出現(xiàn)的變異較大，必須經(jīng)過出菇試驗后才能用于生產(chǎn)中［2］。對于產(chǎn)孢子的真菌，一般其分離法多采用孢子分離法。1.2.1種菇選擇與處理。在選擇種菇時，選取個體典型、大小適中均勻、健壯無雜且成熟度8成的子實體。將選好的種菇的雜物去除，并切除菇柄，用75%酒精抹擦菇體，或用0.1%升汞浸泡1min（銀耳、木耳類膠質菌的子實體只能用無菌水多次沖洗）。然后用無菌水沖洗種菇表面的殘留藥液。用無菌紗布拭干表面水分，并放入滅菌的器皿內備用。1.2.2孢子采集。根據(jù)采集孢子的方法不同，又可分為以下幾種。在用彈射法時，先安裝已滅菌的孢子采集器，將經(jīng)過處理的種菇菌褶朝下固定于三角架（采集器上）之上，扣上罩子，接著用0.1%升汞溶液潤濕紗布并鋪在培養(yǎng)皿的四周，既能防雜菌污染，又能增加罩內的濕度。最后再將整個采集器用滅菌的紗布覆蓋，在適溫漫射光條件下培養(yǎng)12-20h，待孢子散出，選擇在無菌的條件下將落有孢子的培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)［3］。鉤懸法是銀耳、木耳等無菌柄類食用菌生產(chǎn)上常用的孢子采集法。取一金屬針兩頭做成鉤狀，經(jīng)火焰灼燒后一端固定于錐形瓶上，另一端鉤住食用菌的子實體，塞上棉塞，于無菌環(huán)境中室溫擱置約2d，見瓶底有落下的孢子，即除去懸鉤和子實體備用［4］。孢子收集的方法有很多，除了上述方法外，還有貼附法、印模法等。1.2.3孢子分離。孢子分離有2種，分別為多孢分離和單孢分離，都是先收集孢子再經(jīng)過分離選擇，最終制成可供生產(chǎn)使用的菌種。其中多孢分離在生產(chǎn)使用較為普遍，如銀耳、香菇、黑木耳等異宗結合的食用菌，它們的孢子有性別之分，單個孢子生產(chǎn)的菌絲無法結菇，因此需要把多個孢子接種在同一培養(yǎng)基上，發(fā)菌絲后自然交配，經(jīng)挑選得到純種，該操作簡單易行。而蘑菇、草菇等孢子無性別區(qū)分，結實能力較強，單個孢子萌發(fā)即獲得純菌種。但生產(chǎn)上使用的食用菌同宗結合的種類相對較少，因此單孢分離多用于育種，生產(chǎn)上很少采用［5］。1.3基內菌絲分離法從食用菌生長基質中分離選擇獲得純菌種的方法叫基內菌絲分離法。如可利用菇木、耳木、菌棒及土壤等作為分離材料進行分離。此法操作較復雜，但適宜不易采得子實體、錯過子實體發(fā)生時期的菌類或膠質菌的菌種分離。使用此法時要特別注意，干燥耳木或菇木中的菌絲多處在休眠期。接種后有時需恢復25?30d才能斷定菌絲是否能恢復活性。2純化培養(yǎng)菌種分離獲得的菌絲體，經(jīng)純化后方能用于研究以及生產(chǎn)中。純化的操作如下：若菌絲正常萌發(fā)，在潔白濃密菌落的生長前端挑取部分菌絲，接種于合適的培養(yǎng)基，并在室溫下進行培養(yǎng)。如此移接2?3次后，純化培養(yǎng)的目的即可達到。菌種純化后的另一個重要工作就是做好菌種保藏［2］。3菌種保藏方法菌種保藏就是根據(jù)所保藏菌種的生理生化特性和遺傳穩(wěn)定性，人為地創(chuàng)造一個有助于休眠的環(huán)境條件，保持其穩(wěn)定的性狀。同時，還要保持菌種的純培養(yǎng)狀態(tài)，以使其免受到雜菌的污染。絕大多數(shù)菌種貯藏法都是通過人為的方式進行控制，最大限度地降低菌絲體的代謝強度，可通過低溫、干燥、缺氧和饑餓等手段［6］。常見的方法有：一是礦油保藏法。為了有效地防止水分的蒸發(fā)，斜面培養(yǎng)物應用礦物油進行覆蓋，同時還可起到隔絕空氣的作用，進而降低細胞的生理代謝活動，該方法的儲藏溫度在15?25°C，可長時間地保藏菌種。二是繼代培養(yǎng)保藏法，即斜面貯藏法。該方法是將菌種在低溫4C或室溫中進行保藏，并定期進行轉接的一種方法。三是干燥貯藏法。該法適于食用菌的孢子貯藏，是將孢子吸附在砂土、濾紙或硅膠等物體上進行長期貯藏，主要通過除去孢子細胞中的游離水使其代謝停滯并最終進入休眠狀態(tài)。四是蒸餾水保藏法。該方法中保存食用菌菌絲體的溶液可選擇緩沖液或蒸餾水或其他不含有機營養(yǎng)物的鹽類溶液，對于絕大多數(shù)的食用菌菌種的保存均較為適合。有研究證明，真菌的保存液為蒸餾水時，儲藏菌種的時間可達到1?20年［7］。五是冷凍干燥保藏法，它是集干燥、低溫和真空于一體的貯藏方法，廣泛被菌種保藏機構所利用。該方法具有貯存方便、保藏時間長、成本低、運輸方便等優(yōu)點，適于長期對孢子進行保藏[8]。4參考文獻王卓仁.組織分離法在食用菌選擇育種中的原則與實踐[J].中國食用菌，2008，27（4）：12-13，44.殷培峰.桑金錢菌的培養(yǎng)性狀及其生理活性物質的研究[D].蘇州：蘇州大學，2005.江微，楊江華，李川.食用菌菌種分離研究進展[J].農(nóng)技服務，2009，26（7）：161-162.胡昭庚.食用菌菌種分離制作與貯藏[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1999：77-78.殷培峰，浦冠勤.野外藥用真菌的菌種分離和保藏[J].滁州學院學報，2007，9（6）：68-71.劉紅，黃建軍，許麗娟，等.談食用菌菌種的保藏[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2008（18）：122-123.BORMANA，SZEKELYACAMPBELLC，etal.Evaluationoftheviabilityofpathogenicfilamentousfungiafterprolongedstorageinsterilewaterandrevie