禁水過程中大鼠血清中無機離子和尿素氮的變化

禁水過程中大鼠血清中無機離子和尿素氮的變化

身體水平衡的調(diào)節(jié)是干旱環(huán)境中動物生存的一個重要問題。高滲脫水也包括異常的身體水分布，從而影響正常的生理功能。腎臟通過控制排放的尿量來調(diào)節(jié)和調(diào)節(jié)水位，并保持血液滲透的穩(wěn)定性。近年來的研究表明，水通道蛋白質(zhì)（aqps）對水和電解質(zhì)的平衡以及滲透感覺的感受起著重要作用。腎組織中水通道蛋白質(zhì)的形成不僅與原尿滲透有關，還受基底精氨酸加壓（avp）的影響。在這項工作中，我們檢測了大鼠血清中有機離子濃度的變化，并使用免疫組織化學方法對大鼠下肢c-fos的發(fā)現(xiàn)和腎水平通道2（aqp2）的發(fā)現(xiàn)進行了分析，探討了動物對水條件的適應和變化規(guī)律，為研究身體水平衡平衡提供了基礎。1材料和方法1.1大鼠的一般情況成年Wistar大鼠24只,體重180～220g(購自蘭州大學實驗動物中心),室溫安靜環(huán)境下飼養(yǎng).適應一周后稱重,隨機分為4組,每組6只,分別為禁水0d,1d,2d和3d組.飼養(yǎng)期間除第一組正常飲水外其他各組完全禁水(正常給食),各組大鼠禁水相應時間后再次稱重,1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉,取其血液、下丘腦及腎臟組織.1.2無機離子及尿素氮濃度檢測血液盛于離心管中靜置,待血液凝固后離心(3000r/min,10min),收集血清,以全自動血液生物化學分析儀(離子選擇電極法、尿素酶法,OlympusAu400,Japan)檢測血清無機離子及尿素氮濃度.1.3免疫組織化學取各組大鼠下丘腦及腎臟組織,10%福爾馬林溶液固定,常規(guī)石蠟包埋,制成6μm的切片.下丘腦切片每隔5張取兩張,分兩套,一套H.E染色進行核團定位,另一套行c-fos免疫組化染色.將石蠟切片脫蠟至水,采用免疫組化SABC法(鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶復合物試劑盒)檢測,DAB顯色,蘇木精復染,常規(guī)脫水、透明、封片、光鏡觀察并拍照.實驗所用的抗體、免疫組織化學試劑盒和DAB顯色劑均購于武漢博士德生物工程有限公司.1.4模型檢測大鼠pvn表達的面密度值根據(jù)Paxino和Watson大鼠腦立體定位圖譜對H.E染色切片上的PVN進行定位,以確定核團的主部,并對相應的免疫組化切片進行顯微攝像,隨機取各組照片5張(×400),采用方格測試系統(tǒng)交點計數(shù)法分別測算各組大鼠PVN中細胞陽性表達的面密度值(Sv),公式為:Sv=2Ix/Lc,Lc=SPc·a,其中,Ix為陽性表達的細胞與測試方格的交點數(shù);Pc為測試系統(tǒng)落在參照系的點數(shù);a為方格的兩點間距離.1.5免疫c-fos在pvn和aqp2中表達強度的變化用Image-proplus5.0專業(yè)圖像分析軟件(MediaCybernetics)進行圖像分析,從每套免疫組織化學切片中選取典型對應面,檢測c-fos在PVN中的表達強度及AQP2在腎臟集合管中的表達強度.陽性表達強度以統(tǒng)計場總面積平均光度值(averageopticaldensity,AOD)表示.1.6統(tǒng)計分析統(tǒng)計分析使用SPSS13.0軟件,采用單因素方差分析.實驗結(jié)果以平均值±標準差(Mean±SD)表示.2結(jié)果2.1度和cl-濃度血清無機離子及尿素氮(UN)濃度變化結(jié)果見表1.禁水1～3d,Na+濃度分別增加7.69%,12.95%,22.30%;Cl-濃度分別增加10%,17.91%,31.84%;UN濃度分別增加41.97%,51.15%,93.73%.血清P3+與Mg2+在禁水第2d后均有不同程度增加.2.2大鼠pvn中c-fos表達情況免疫組織化學顯示c-fos表達陽性細胞核著色,呈棕黃色(圖版Ⅰ:1-4).禁水過程中各組大鼠PVNc-fos表達部位的面密度值及平均吸光度如表2所示.在0d組大鼠PVN中c-fos呈弱陽性,隨著禁水時間的延長,c-fos在PVN中表達的面密度值逐漸增大,雖然禁水1d組較0d組無明顯差異(P>0.05),但其在PVN中表達的平均吸光度與0d組之間具顯著差異,禁水2d及3d組較0d組面密度值明顯增大,差異極顯著(P<0.01).2d組及3d組免疫反應呈強陽性,細胞核深染,與0d組差異極顯著(P<0.01).2.3aqp2在臟器臟器集合管中表達的平均吸光度.AQP2在腎臟中的陽性表達位于集合管主細胞的頂質(zhì)膜及細胞胞漿內(nèi),陽性表達部位呈棕黃色(圖版Ⅰ:5-8).AQP2在各組大鼠腎臟集合管中表達的平均吸光度如表3所示.禁水1～3d,AQP2表達分別增加29.15%,67.78%,120.58%.3大鼠體重、體重和體重變化的比較Na+和Cl-是維持細胞內(nèi)外滲透壓的重要離子,項光華等研究發(fā)現(xiàn)雙峰駝于禁水后血清中Na+和Cl-的含量呈升高趨勢.在禁水過程中,血清中Na+,Cl-離子濃度在禁水1天即升高,隨著時間的延長而進一步升高,而血清中Mg2+,P3+上升較遲,在禁水的第2d升高.血清中Ca2+,K+離子變化不顯著.血清中無機離子濃度的變化,影響著體液滲透壓的變化和機體對水分的吸收和排出,也起到調(diào)節(jié)機體水代謝的作用.尿素氮是動物蛋白質(zhì)代謝的主要終末產(chǎn)物,研究發(fā)現(xiàn)用甘露醇使機體脫水,使血液濃縮可導致血液尿素氮增高.各組大鼠血清中尿素氮的濃度隨著禁水時間的延長而顯著升高,提示血清尿素含量較高.尿素的升高受到多種因素影響,禁水過程中1d,2d,3d組大鼠的體重持續(xù)降低(分組前:(202.33±4.72)g,1d:(178.22±6.11)g,2d:(163.67±6.03)g,3d:(150.33±4.16)g),剖開腹腔可見胃中食糜較0d組均有減少.尿素的上升除受機體缺水的影響,也可能與大鼠的攝食量減少,蛋白質(zhì)代謝增加有關.c-fos是一種即刻早期基因,中樞神經(jīng)細胞受到特異性刺激后,相應細胞內(nèi)c-fos將快速表達,c-fos蛋白大量合成并迅速堆積于胞核.多種刺激均可引起神經(jīng)元c-fos的表達,因此c-fos常被用作神經(jīng)元功能活動標記物.下丘腦室旁核(PVN)是合成多種神經(jīng)調(diào)節(jié)肽的核團之一,參與應激、水與電解質(zhì)平衡、代謝等多種功能調(diào)節(jié).有研究表明腦室內(nèi)注射高滲氯化鈉能夠刺激下丘腦分泌精氨酸加壓素(AVP)和心鈉素(ANP)增多,并誘導c-fos在PVN中的表達,下丘腦PVN的神經(jīng)元活性可被腦室內(nèi)滲透壓增高而激活;而下丘腦PVN損傷后則可出現(xiàn)尿崩癥,它由PVN分泌AVP減少所致.禁水1d,下丘腦室旁核c-fos表達陽性的面密度值變化不顯著,但平均光密度增加,提示陽性細胞數(shù)量變化可能增多不大,而細胞中表達的量顯著增多.2d與3d天組二者均顯著增加,且隨禁水時間的延續(xù),表達持續(xù)增多.本研究結(jié)果顯示PVN內(nèi)c-fos表達的面密度值與平均吸光度隨著禁水時間的延長而增加,提示一定程度上c-fos的表達可能與機體缺水的嚴重程度相關.AQP2存在于腎臟集合管主細胞,分布在細胞的頂質(zhì)膜和胞內(nèi)小泡內(nèi).AQP2在細胞內(nèi)分布受AVP激素調(diào)控.當給予AVP后胞內(nèi)小泡中的AQP2轉(zhuǎn)移到細胞頂質(zhì)膜,增加細胞膜的水通透性.AQP2參與腎組織水重吸收的調(diào)控,AVP增加集合管水滲透通透性與內(nèi)髓集合管頂膜AQP2的密度有關.研究表明AQP2基因突變后可使集合管重吸收水的功能異常,繼而引起尿崩癥,這說明了AQP2在調(diào)節(jié)