HPLC分析方法開(kāi)發(fā)：分離度的認(rèn)識(shí)與思考

HPLC分析方法開(kāi)發(fā)：分離度的認(rèn)識(shí)與思考對(duì)于色譜工作者而言，面對(duì)復(fù)雜成分的檢測(cè)，分離是首要的關(guān)注點(diǎn)。無(wú)法有效分離意味著無(wú)法進(jìn)行準(zhǔn)確的定性、定量檢測(cè)。中國(guó)藥典通則0500色譜法規(guī)定，高效液相色譜法、離子色譜法及氣相色譜法等要求“除另有規(guī)定外，待測(cè)物質(zhì)色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度應(yīng)不小于1.52一、什么是基線分離？基線分離是每一個(gè)色譜分離工作者在兼顧效率前提下的終極追求。理論上，當(dāng)分離度等于L5時(shí)，即可認(rèn)為達(dá)到了基線分離。為什么是“即可認(rèn)為。而不是絕對(duì)認(rèn)為呢？這里面涉及到正態(tài)分布/高斯分布，30,6。等概念。這些概念稍顯頑固，我們給予記過(guò)并留待察看，暫不深入追究。用點(diǎn)色譜參數(shù)里常用的名詞，再加一點(diǎn)通俗語(yǔ)言來(lái)說(shuō)就是，對(duì)稱因子為L(zhǎng)0的兩個(gè)高矮胖瘦一模一樣的色譜峰，當(dāng)分離度為L(zhǎng)5時(shí)可認(rèn)為是基線分離。比如，下圖1顯示的某藥典給出的示例圖。Peak1 Peak2圖1基線分離示例但是，理論指導(dǎo)實(shí)踐，實(shí)踐是檢驗(yàn)真理的唯一標(biāo)準(zhǔn)。比如說(shuō)，上面對(duì)于基線分離的描述情形，在實(shí)際工作中基本不可能，而且說(shuō)“基本”是為了滿足“一切皆有可能”的嚴(yán)謹(jǐn)，否則可以直接說(shuō)“根本不可能”。因?yàn)榈聡?guó)哲學(xué)家萊布尼茨說(shuō)，世界上沒(méi)有完全相同的兩片樹(shù)葉，而每一個(gè)色譜工作者都可以說(shuō)，世上沒(méi)有完全相同的兩個(gè)色譜峰。實(shí)際情況是，往往相鄰色譜峰各有千秋，導(dǎo)致同一個(gè)分離度會(huì)出現(xiàn)完全不同的分離效果。比如下圖2,兩個(gè)不同比例的色譜峰，在不同分離度情況下的分離表現(xiàn)，在分離度0?6時(shí)尤為明顯：當(dāng)后峰是前峰的1/16時(shí)，還能看出是兩個(gè)峰嗎？JM1/16JM1/16圖2分離度及譜峰相對(duì)大?。娣e）與分離度關(guān)系《實(shí)用高效液相色譜法的建立》既然如此，那我們就不要再執(zhí)念于分離度L5了，也不要自欺欺人的出具一個(gè)顯示分離度大于1.5的色譜報(bào)告而不看實(shí)際分離效果了。二、分離度如何定？很多人都做過(guò)仿制藥、改良型新藥，甚至創(chuàng)新藥！99.9%的核心技術(shù)思想離不開(kāi)模仿、借鑒，還有0.1%留給那些從0到1的“傳說(shuō)”。下表1列舉了從中國(guó)藥典以及歐洲藥典中隨機(jī)摘錄了一些典型的實(shí)例，對(duì)于分離要求可以說(shuō)是“五花八門”。表1不同品種對(duì)于分離度的要求舉例來(lái)源品種名稱分離度要求中國(guó)藥典乙酰谷酰胺乙酰谷酰胺峰與谷發(fā)酰胺峰之間的分離度放大「7.0己酮可可堿茶堿峰與咖啡因峰的分離度應(yīng)大于4,咖啡因峰與己酮回工￡減峰的分離度應(yīng)大于lO.Oo馬來(lái)酸依那普利馬來(lái)酸峰與雜質(zhì)I峰之間的分離度應(yīng)符介要求雜質(zhì)I峰、依那普利峰與雜質(zhì)n峰之間的分離度應(yīng)大于4.0,歐洲藥典BETAMETHASONEACETATE醋酸值他米松minimum3.3benveenthepeaksduetobetamethasoneacetateandimpurityB。醋酸依他米松峰與雜質(zhì)B峰分離度應(yīng)大了3.3。BETAMETHASONEVALERATE戊酸值他米松nimimuin1.7betweenthepeaksduetoimpuritiesHandD.雜質(zhì)H與雜質(zhì)D分離度應(yīng)大于1.7oBROMOCRIPTINEMESILATE甲磺酸澳隱亭minimum1.1betweenthepeaksduetoimpuritiesAandB.雜質(zhì)A與雜質(zhì)B分離度應(yīng)大F1.1oCLOPIDOGRELHYDROGENSULFATE硫酸履履山格宙peak-to-valleyratio:minimum10,wliereHp=heightabovethebaselineofthepeakduetoimpurityBandHv=heightabovethebaselineofthelowestpointofthecurveseppratinRthispeakfromthepeakduetoclopidogrel.峰谷比:雜質(zhì)B疆氯山格雷峰之間的峰谷比應(yīng)大卜lO.Oo如果說(shuō)中國(guó)藥典中的例子還算中規(guī)中矩的拓寬了我們對(duì)分離度1.5的認(rèn)識(shí)，那歐洲藥典分離度3.3、1.7、1.1是什么操作？這種有零兒有整兒的分離度是怎么搞出來(lái)的兒？峰谷比又是什么操作，跟分離度有什么區(qū)別，我該怎么選？看完以后什么感覺(jué)？眼花繚亂，再加上點(diǎn)眩暈，有點(diǎn)上頭！帶著一腦門兒的問(wèn)號(hào)，總感覺(jué)，法典里透著點(diǎn)草率，嚴(yán)謹(jǐn)中不失那么點(diǎn)隨意。要不是看在歐洲藥典的面子上，領(lǐng)導(dǎo)不得罵的你找不著北？既然歐洲藥典都可以這么干，那我們能不能也模仿、借鑒一下？能！大寫的。而且，在這個(gè)彰顯個(gè)性，鼓勵(lì)創(chuàng)新的時(shí)代里，建議不要做分離度1」、3.3這種純仿制，也不要假模假式的做一些分離度1.2.3.4這種me-too,可以嘗試做一些分離度2.2、4.4這種me-better,或者大膽一點(diǎn)做一些分離度1.03、2.21這種四不像。三、如何證明合理性？實(shí)際工作中也接觸到不少人有這個(gè)想法：當(dāng)分離度連中國(guó)藥典那除另有規(guī)定外的L5都達(dá)不到時(shí)，開(kāi)始動(dòng)了定分離度1?0、1.2的心思。但往往只是大筆一揮而已！比如，方法開(kāi)發(fā)及方法驗(yàn)證時(shí)實(shí)際分離度為1.4,為了日后方法系統(tǒng)適用性通過(guò)性的保險(xiǎn)起見(jiàn)，懷著一絲的忐忑，帶著歐洲藥典的一絲安慰，標(biāo)準(zhǔn)制定時(shí)寫下了L2,大膽一點(diǎn)的直接來(lái)個(gè)1.0。合理嗎？有人說(shuō)之所以定了1.2,是來(lái)源于耐用性驗(yàn)證時(shí)在某條件下的最差分離度。暫且不去推測(cè)該耐用性試驗(yàn)是如何設(shè)計(jì)的，但我相信大多數(shù)情況下對(duì)于制定1.2分離度的證明性是不夠的。當(dāng)然，不僅是達(dá)不到分離度L5時(shí)的退讓，更有很多達(dá)到1.5后的前進(jìn)，比如分離度應(yīng)大于lO.Oo這些數(shù)值的制定不僅僅是一個(gè)耐用性的探索，更不是冒險(xiǎn)或保守之類的估計(jì)，而是需要具體的試驗(yàn)設(shè)計(jì)去驗(yàn)證。方法學(xué)驗(yàn)證設(shè)計(jì)（針對(duì)分離度或峰谷比制定）簡(jiǎn)述如下（如有遺漏謬誤還請(qǐng)自行腦補(bǔ)修正,朝著目標(biāo)前進(jìn)）：1、擬定分析方法耐用性的關(guān)鍵參數(shù)：碳酸鏤溶液濃度、流速、柱溫、色譜柱及儀器。2、擬定關(guān)鍵耐用性參數(shù)在日常檢測(cè)中可能出現(xiàn)的偏離，比如碳酸鍍?nèi)芤簼舛扔捎谂渲七^(guò)程導(dǎo)致的誤差，由于儀器本身性能導(dǎo)致的流速及柱溫控制差異，色譜柱批次間的差異，不同儀器（型號(hào)、品牌）之間的差異。這些差異均可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)及相關(guān)的性能確認(rèn)（PQ）進(jìn)行預(yù)先估計(jì)，在估計(jì)的基礎(chǔ)上適當(dāng)放寬考察。3、在上述各種擬定的偏離條件下進(jìn)行分離度考察，確定最差分離度，比如說(shuō)是在流速2.2ml/min時(shí)分離度為最差的l.lo4、在流速2.2ml/min,分離度為1.1的條件下，設(shè)計(jì)雜質(zhì)A與雜質(zhì)B的靈敏度（檢測(cè)限、定量限），線性與范圍，準(zhǔn)確度（加標(biāo)回收）試驗(yàn)。此時(shí)，我們甚至可以在該條件下兼顧其他雜質(zhì)的再次驗(yàn)證。5、在最差分離度條件下，各項(xiàng)驗(yàn)證均滿足擬定的驗(yàn)證要求時(shí)（不一定非得完全按照中國(guó)藥典9101的要求），可以合理的制定所希望的分離度或峰谷比。此外，尚需說(shuō)明一點(diǎn)的是，耐用性不是通過(guò)性驗(yàn)證,無(wú)需擬定范圍后追求耐用性試驗(yàn)的通過(guò)。耐用性的參數(shù)應(yīng)在方法開(kāi)發(fā)階段已完成邊界的探索，并進(jìn)行了初步的驗(yàn)證；在方