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NGS文庫(kù)相關(guān)本卷須知4樣本建庫(kù)的判定基準(zhǔn)123文庫(kù)出庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)文庫(kù)定量混庫(kù)和Pooling注意核酸樣本優(yōu)良的區(qū)分總量、純度、完整性A230:碳水化合物在230nm具有最高吸收峰的吸收波長(zhǎng);A260:核酸在260

nm具有最高吸收峰的吸收波長(zhǎng);A280:蛋白質(zhì)在280nm波長(zhǎng)處有最高吸收峰;A230,A260,A280純DNA或者RNA:A260/A230=2.5>2.5儀器帶來(lái)的誤差;<2.5樣品被碳水化合物〔糖類〕、鹽類或有機(jī)溶劑污染,需要純化樣品〔<2.0〕。純DNA:A260/A280=1.8純RNA:A260/A280=2.0

DNA>1.8有蛋白質(zhì)污染〔<1.6〕;RNA<2.0有蛋白污染〔<1.8〕,>2.2時(shí),說(shuō)明RNA已經(jīng)水解成單核酸了。RIN(RNAIntegrityNumber)RNA的降解那么表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散,以Agilent2100進(jìn)行毛細(xì)管電泳并以軟件的RIN(RNAIntegrityNumber)分?jǐn)?shù)評(píng)估,10為RNA完整性最好,0為最差。原核生物:5S、16S及23S,5S含有120個(gè)核苷酸,16S含有1540個(gè)核苷酸,而23S含有2900個(gè)核苷酸;真核生物:5S、5.8S、18S和28S,分別具有大約120、160、1900和4700個(gè)核苷酸。S為沉降系數(shù)〔sedimentationcoefficient〕,當(dāng)用超速離心測(cè)定一個(gè)粒子的沉淀速度時(shí),此速度與粒子的大小直徑成比例。樣本-DNA問(wèn)題樣本的常見(jiàn)特征1.降解;2.污染;3.粘稠;問(wèn)題樣本的常見(jiàn)特征-降解基因組DNA輕微降解基因組DNA中度降解基因組DNA嚴(yán)重降解樣本-RNA樣本異常-顏色輕微顏色異常中度顏色異常深度顏色異常真核mRNA樣本建庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)參考真核LncRNA樣本建庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)參考真核miRNA樣本建庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)參考真核DNA樣本建庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)參考真核外顯子樣本建庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)參考-基因組真核外顯子樣本建庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)參考-單細(xì)胞真核外顯子樣本建庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)參考-特殊樣本測(cè)序策略對(duì)片段的限制范圍測(cè)序策略最適片段范圍(加接頭120bp)風(fēng)險(xiǎn)片段范圍(加接頭120bp)PE150320bp-520bp300bp-600bp文庫(kù)判定-定性出庫(kù)濃度:總量20ng,濃度2ng/ulqPCRMix準(zhǔn)備qPCR標(biāo)準(zhǔn)品制備文庫(kù)稀釋液的準(zhǔn)備8連排及qPCR管的準(zhǔn)備數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作樣品倍乘稀釋Mix分裝qPCR反應(yīng)液的準(zhǔn)備并混勻上機(jī)操作作用:定量檢測(cè)文庫(kù)的有效濃度;工作原理:在PCR反響體系中參加熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程;合格標(biāo)準(zhǔn):一般在求在2-30nM之間,微生物建庫(kù)要求在4-30nM之間。文庫(kù)判定-定量qPCR文庫(kù)判定-定量QPCR結(jié)果:滿足摩爾濃度至少3nM/ul.文庫(kù)稀釋液稀釋100倍稀釋100倍稀釋10000X檢查庫(kù)檢表,并準(zhǔn)備文庫(kù)檢查試劑和芯片是否夠用,并平衡到室溫檢查儀器設(shè)備是否可用實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作清洗電極檢查壓膠器,壓膠加marker、ladder,樣品上機(jī)操作清洗電極并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理作用:定性檢測(cè)文庫(kù)的片段長(zhǎng)度;工作原理:基于微流控芯片實(shí)驗(yàn)技術(shù);合格標(biāo)準(zhǔn):插入片段偏差在20%以下,主峰明顯、無(wú)雜峰,無(wú)接頭和無(wú)引物二聚體。文庫(kù)判定-定性2100文庫(kù)判定-上機(jī)POolin

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