NGS基礎(chǔ)培訓(xùn)課件

NGS文庫相關(guān)本卷須知4樣本建庫的判定基準(zhǔn)123文庫出庫的標(biāo)準(zhǔn)文庫定量混庫和Pooling注意核酸樣本優(yōu)良的區(qū)分總量、純度、完整性A230：碳水化合物在230nm具有最高吸收峰的吸收波長；A260：核酸在260

nm具有最高吸收峰的吸收波長；A280：蛋白質(zhì)在280nm波長處有最高吸收峰；A230，A260,A280純DNA或者RNA：A260/A230=2.5>2.5儀器帶來的誤差；<2.5樣品被碳水化合物〔糖類〕、鹽類或有機(jī)溶劑污染，需要純化樣品〔<2.0〕。純DNA：A260/A280=1.8純RNA：A260/A280=2.0

DNA>1.8有蛋白質(zhì)污染〔<1.6〕；RNA<2.0有蛋白污染〔<1.8〕，>2.2時，說明RNA已經(jīng)水解成單核酸了。RIN(RNAIntegrityNumber)RNA的降解那么表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散，以Agilent2100進(jìn)行毛細(xì)管電泳并以軟件的RIN(RNAIntegrityNumber)分?jǐn)?shù)評估，10為RNA完整性最好，0為最差。原核生物：5S、16S及23S，5S含有120個核苷酸，16S含有1540個核苷酸，而23S含有2900個核苷酸；真核生物：5S、5.8S、18S和28S，分別具有大約120、160、1900和4700個核苷酸。S為沉降系數(shù)〔sedimentationcoefficient〕，當(dāng)用超速離心測定一個粒子的沉淀速度時，此速度與粒子的大小直徑成比例。樣本-DNA問題樣本的常見特征1.降解；2.污染；3.粘稠；問題樣本的常見特征-降解基因組DNA輕微降解基因組DNA中度降解基因組DNA嚴(yán)重降解樣本-RNA樣本異常-顏色輕微顏色異常中度顏色異常深度顏色異常真核mRNA樣本建庫標(biāo)準(zhǔn)參考真核LncRNA樣本建庫標(biāo)準(zhǔn)參考真核miRNA樣本建庫標(biāo)準(zhǔn)參考真核DNA樣本建庫標(biāo)準(zhǔn)參考真核外顯子樣本建庫標(biāo)準(zhǔn)參考-基因組真核外顯子樣本建庫標(biāo)準(zhǔn)參考-單細(xì)胞真核外顯子樣本建庫標(biāo)準(zhǔn)參考-特殊樣本測序策略對片段的限制范圍測序策略最適片段范圍(加接頭120bp)風(fēng)險片段范圍(加接頭120bp)PE150320bp－520bp300bp－600bp文庫判定-定性出庫濃度：總量20ng，濃度2ng/ulqPCRMix準(zhǔn)備qPCR標(biāo)準(zhǔn)品制備文庫稀釋液的準(zhǔn)備8連排及qPCR管的準(zhǔn)備數(shù)據(jù)處理實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作樣品倍乘稀釋Mix分裝qPCR反應(yīng)液的準(zhǔn)備并混勻上機(jī)操作作用：定量檢測文庫的有效濃度；工作原理：在PCR反響體系中參加熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程；合格標(biāo)準(zhǔn)：一般在求在2-30nM之間，微生物建庫要求在4-30nM之間。文庫判定-定量qPCR文庫判定-定量QPCR結(jié)果：滿足摩爾濃度至少3nM/ul.文庫稀釋液稀釋100倍稀釋100倍稀釋10000X檢查庫檢表，并準(zhǔn)備文庫檢查試劑和芯片是否夠用，并平衡到室溫檢查儀器設(shè)備是否可用實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備工作清洗電極檢查壓膠器，壓膠加marker、ladder，樣品上機(jī)操作清洗電極并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理作用：定性檢測文庫的片段長度；工作原理：基于微流控芯片實(shí)驗(yàn)技術(shù)；合格標(biāo)準(zhǔn)：插入片段偏差在20%以下，主峰明顯、無雜峰，無接頭和無引物二聚體。文庫判定-定性2100文庫判定-上機(jī)POolin