半枝蓮通過線粒體通路誘導小鼠肝癌細胞凋亡

半枝蓮提取物通過與caspase-3有關的線粒體通路誘導肝癌細胞H22細胞凋亡

半枝蓮是一種多年生草本植物，在中藥中也被稱為半枝蓮。主要分布在華南地區(qū)，已被用作中國和韓國的肺癌，消化系統(tǒng)癌癥，肝癌，乳腺癌和絨毛膜上皮瘤的抗腫瘤劑以及抗炎藥和利尿劑。來自半枝蓮的提取物(ESB)在體外對許多人類癌癥（包括白血病，結腸癌，肝癌和皮膚癌）的生長有抑制作用。然而，其抗腫瘤機制仍不清楚。據(jù)報道，許多中草藥具有抗癌特性，可以誘導細胞凋亡凋亡?，F(xiàn)已經(jīng)解決的三種凋亡途徑，包括線粒體途徑，死亡受體途徑和內質網(wǎng)應激介導的細胞凋亡途徑。在大多數(shù)生理和病理情況下，線粒體通路啟動細胞凋亡。吳茱萸中二氫吳茱萸新堿的定量分析

背景在線粒體啟動的途徑中，經(jīng)歷滲透性轉換的線粒體將線粒體膜間隔的細胞色素C或細胞凋亡誘導因子的細胞凋亡蛋白釋放到細胞溶質中。釋放的細胞色素C可以激活caspase-9，并且激活的caspase-9反過來切割并激活子caspase-3。caspase-3激活后，caspase-3的某些特異性底物如聚（ADP-核糖）和聚合酶（PARP）被切割，最終導致細胞凋亡。

吳茱萸中二氫吳茱萸新堿的定量分析1.實驗目的：研究半枝蓮對肝癌細胞的生長抑制作用和它對肝癌細胞凋亡的影響確定半枝蓮抑制小鼠肝癌細胞H22活性的機制。吳茱萸中二氫吳茱萸新堿的定量分析2.實驗材料與試劑

吳茱萸中二氫吳茱萸新堿的定量分析新鮮牛血清，RPMI-1640培養(yǎng)基，碘化丙啶（PI），二甲基亞砜（DMSO），核糖核酸酶（RNaseA），羅丹明123（Rh123），3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化物（MTT），抗caspase-3和細胞色素C的小鼠單克隆抗體。凋亡細胞Hoechst33258檢測試劑盒，熒光探針羅丹明123。體重220-250g的雄性SD大鼠。含有血清的藥物的制備使用“血清藥理學”來研究藥物的體外藥理活性。參考以往文獻制備含ESB的血清。20只雄性SD大鼠隨機分為對照組，高ESB劑量組，中等ESB劑量組和低ESB劑量組（n=5）。高、中、低ESB劑量組的大鼠以6，3和1.5g/d/kg的計量灌胃給予ESB。對照組大鼠接受生理鹽水，每日2次，共3天。在最后一次給藥兩小時后，立即從心臟獲得血液，并在室溫下保持4小時。通過以2400r/min離心10分鐘分離血清，用0.22μm醋酸纖維素膜過濾收集兩次，在56℃水中冷凍30分鐘，并儲存在-20℃下使用。吳茱萸中二氫吳茱萸新堿的定量分析2.實驗材料與試劑3.實驗方法與結論，補吳茱萸中二氫吳茱萸新堿的定量分析MTT法檢測H22細胞增殖情況方法：將H22細胞在96孔板中以5×103個細胞/孔的濃度接種，并在37℃下生長直到粘附。處理后，加入50μg/10μL的MTT，將細胞再孵育4小時。除去上清液后，向每個孔中加入200μLDMSO。振蕩板10分鐘后，使用酶標儀（EX-800型）測定90nm波長處的吸光度，檢測細胞活力。細胞活力（％）=實驗吸光度組/空白對照組吸光度×100％。H22細胞用不同劑量的ESB處理，分別在0,24,48,72和96h后評價H22細胞的生長速度。不同ESB治療組H22細胞的細胞活力顯著高于5-FU治療組（圖1），高劑量ESB明顯抑制H22細胞增殖（P<0.05），低劑量ESB不能明顯抑制H22細胞增殖（P>0.05）。MTT測定顯示高劑量和中等劑量的ESB以時間依賴的方式在體外抑制H22細胞的增殖。吳茱萸中二氫吳茱萸新堿的定量分析形態(tài)學凋亡檢測

透射電子顯微鏡：用高度劑量的ESB處理粘附的H22細胞48小時。處理的細胞用胰酶消化，并在4℃預冷3％戊二醛固定2小時。載玻片制作部分，用PBS洗滌細胞，在1％的鋨酸中固定另外1小時，在丙酮中脫水并包埋在環(huán)氧樹脂中。用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后，置Hitachi-800透射電子顯微鏡下觀察。

熒光顯微鏡：通過離心獲得H22細胞，用PBS洗滌并在室溫下在1％戊二醛中固定1小時。用PBS洗滌固定的細胞，用200μmol/LHoechst33258染色10分鐘。在熒光顯微鏡上觀察用Hoechst33258染色的細胞核的變化。

3.實驗方法與結論高分辨率透射電子顯微鏡顯示正常的H22細胞是圓形和規(guī)則的，在少數(shù)腫瘤細胞中具有染色質邊緣（圖2A）。在高ESB劑量治療48小時后，部分核膜以尖銳的角度向外突出。H22細胞典型的凋亡形態(tài)出現(xiàn)如，在高ESB劑量組（圖2B-D）中可以觀察到細胞核的色素凝集和碎裂，軟骨細胞腫脹，凋亡體形成。A：正常肝細胞H22細胞B：高ESB劑量組的核染色和色素凝集;C：高ESB劑量組凋亡小體D：高ESB劑量組的軟骨細胞腫脹A：對照組B：低劑量治療組C：中劑量治療組;D：高劑量治療組用不同劑量的ESB治療48h后，用Hoechst33258染色H22細胞在熒光顯微鏡下觀察。凋亡細胞的染色質比正常細胞更亮。凋亡的特征，如核收縮，DNA縮合和分裂，在ESB