dna熒光原位雜交技術(shù)的研究進展

dna熒光原位雜交技術(shù)的研究進展

21世紀(jì)80年代末，以第二面原意義上的異構(gòu)象——昆蟲遺傳改良（fish）技術(shù)是根據(jù)現(xiàn)有的核電站原狀位異形象技術(shù)發(fā)展起來的。目前已廣泛應(yīng)用于動植物基因組結(jié)構(gòu)的研究,分辨復(fù)雜的染色體易位、病毒的感染、DNA物理圖譜的構(gòu)建、人類的產(chǎn)前診斷及哺乳動物染色體進化研究領(lǐng)域等許多方面。它與放射性同位素技術(shù)相比具有快速、安全、靈敏度高、探針可長期保存等特點。FISH技術(shù)與傳統(tǒng)的細胞遺傳學(xué)技術(shù)相結(jié)合正開創(chuàng)著分子細胞遺傳學(xué)新天地。1探針的標(biāo)記方法熒光原位雜交技術(shù)的基本原理是將DNA探針用特殊修飾的核苷酸分子標(biāo)記,然后將標(biāo)記的探針直接原位雜交到染色體或DNA纖維切片上,再用與熒光素分子藕聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異性結(jié)合來檢測DNA序列在染色體或DNA纖維上的定位、定性、相對定量分析。常用的探針可分三類:①染色體特異重復(fù)序列探針(probetochromosome-specificrepeatedsequence)。像α衛(wèi)星、衛(wèi)星Ⅲ類的探針,他們的雜交靶位常大于1Mb,不含散在重復(fù)序列,與靶位結(jié)合緊密,雜交信號強,易于檢測,常用于監(jiān)測間期細胞非整倍體和微小標(biāo)志染色體;②全染色體或染色體區(qū)域特異性探針(whole-chromosomeorchromosomeregion-specificprobes)。由一條染色體或其上某一區(qū)域的極端不同核酸片段組成,可由克隆到噬菌體(phage)和粘質(zhì)粒(cosmids)上的染色體特異性大片段插入文庫制取,且微切文庫探針片段小,與鄰近區(qū)域發(fā)生重疊及制片過程中被破壞的可能性小。這類探針可用于中期染色體重組和間期核結(jié)構(gòu)分析;③特異性位置探針(specific-locusprobe)。常有一個或幾個克隆序列組成,可由cDNA克隆或克隆到大片段插入載體的核酸片段制取,主要用來進行染色體克隆DNA序列定位和檢測靶DNA序列拷貝數(shù)及結(jié)構(gòu)變化。探針的熒光素標(biāo)記分為間接標(biāo)記和直接標(biāo)記。間接標(biāo)記是用生物素標(biāo)記的dUTP(biotin-dUTP)通過缺口平移法標(biāo)記,雜交后再用藕聯(lián)有熒光素的抗生物素抗體檢測。通過幾輪抗生素蛋白-熒光素、生物素化的抗-抗生物素蛋白、抗生物素蛋白-熒光素的一系列處理,可放大被檢測信號,監(jiān)測小至500bp的靶序列。直接標(biāo)記是通過熒光素直接與探針核苷或磷酸戊糖骨架共價結(jié)合、或缺口平移法標(biāo)記探針時摻入熒光素核苷三磷酸標(biāo)記探針。直接標(biāo)記的探針經(jīng)過簡單沖洗就可鏡檢,省去了間接標(biāo)記的探針雜交后繁瑣的檢測步驟,但不能像間接標(biāo)記的探針那樣進行多步驟信號放大,因而不如間接標(biāo)記的探針靈敏,但靶較大時(數(shù)百kb),還是較可靠,且探針標(biāo)記種數(shù)不受高親合力配基(high-affinitybindingparter)能力限制。用激發(fā)光譜和吸收光譜不同的熒光素按一定調(diào)色方法標(biāo)記探針,就可同時分析不同探針對應(yīng)的靶DNA。熒光顯微鏡常用于FISH信號檢測,但隨著數(shù)字成像技術(shù)和共焦顯微技術(shù)的發(fā)展,數(shù)字顯微鏡(digitalimagingmicroscopy)、共焦顯微鏡(confocalmicroscopy)越來越多的用于探針圖譜、基因工程拷貝數(shù)、染色體易位、轉(zhuǎn)移細胞的自動化分析、基因型和表型間的關(guān)系,促進對遺傳畸變所致生物學(xué)改變的深入認識。2fish在不同領(lǐng)域的應(yīng)用2.1熒光顯微鏡觀察FISH技術(shù)能快速、精確地確定雜交后探針在染色體上的位置,由于它可以用不同的修飾核苷酸分子標(biāo)記不同的DNA探針,再用不同的熒光素分子檢測不同層次的探針分子,因此,可以在熒光顯微鏡下在同一張切片上同時觀察幾種DNA探針的定位,直接得到它們的相關(guān)位置和順序。2.1.1采用fransz的滴片技術(shù)鐘筱波等、zhong等在Arabidopsis、番茄、水稻等多種植物中觀察分析后發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂前期的粗線期染色體(pachytenechromosome)最具進行高分辨率FISH的潛力。這一時期的染色體濃縮度比中期染色體大為降低。鐘筱波等以LycopesiconesculenlumcvVFNTcherry番茄為材料用Fransz的滴片技術(shù)選取端粒區(qū)內(nèi)的端粒重復(fù)序列和端粒聯(lián)接重復(fù)序列。生物素標(biāo)記的Arabidopsisthaliana端粒重復(fù)序列探針PAtT4和地高辛標(biāo)記的番茄端粒聯(lián)接重復(fù)序列TGR1,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PAtT4探針雜交到所有番茄染色體端粒上,TGR1只雜交在24個端粒中的20個,其中第1、2、7條染色體的長臂和第2條染色體的短臂不含TGR1序列。2.1.2dna序列結(jié)構(gòu)的雜交Heng等、Fransz等許多學(xué)者先后用植物、動物為材料在DNA纖維(extendedDNAfibre)進行FISH,已將分辨率水平提高到與常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)SouthernBlot分析的水平。鐘筱波等以LycopersiconesculenlumcvVFNTcherry番茄為材料,以PAtT4和TGR1作探針,在DNA纖維上進行原位雜交,結(jié)果得到DNA序列結(jié)構(gòu)的3種情況:①端粒重復(fù)序列與TGR1相聯(lián),但有一段未知的序列處于這兩種重復(fù)序列之間,這兩種重復(fù)序列之間的距離在不同的端粒之間從表面上看10kb到60kb不等;②端粒重復(fù)序列與TGR1緊密相聯(lián);③端粒重復(fù)序列與TGR1不相聯(lián),這些信號可能與此4個不含TGR1的端粒(1L、2S、2L和7L)有關(guān)。由此可見,在DNA纖維上進行原位雜交可以直接準(zhǔn)確地獲得不同DNA序列之間的排列關(guān)系,推算出番茄端粒重復(fù)序列和端粒聯(lián)接重復(fù)序列之間的距離小于60kb。2.2融資約束后的基因整合目前,應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)研究轉(zhuǎn)基因的整合已有許多報道。研究表明,轉(zhuǎn)基因的表達和整合位點有關(guān),整合的位點不同,基因的表達有明顯差異。轉(zhuǎn)基因的整合,還可能會引起插入突變,產(chǎn)生明顯的表型效應(yīng)。檢測轉(zhuǎn)基因的整合位點,對于深入研究轉(zhuǎn)基因的作用及其表達調(diào)控是至關(guān)重要的。此外,轉(zhuǎn)基因動物的繁育中,為了獲得純合子動物,常需進行多代間雜交,而應(yīng)用熒光原位雜交則能快速直接的篩選到純合子。苗聰秀等應(yīng)用FISH技術(shù)對EB病毒(與人鼻咽癌的發(fā)生關(guān)系密切,體外研究表明,EB病毒潛伏膜蛋白基因(BNLF-1)是EB病毒的致癌基因)潛伏膜蛋白的基因的整合位點進行了檢測。用2只轉(zhuǎn)基因小鼠,1只正常小鼠的染色體標(biāo)本用生物素標(biāo)記的BNLF-1基因探針進行原位雜交,結(jié)果表明1號鼠的雜交信號位于14號染色體的A區(qū),2號鼠的雜交信號位于10號染色體的C區(qū)。在兩只子代的轉(zhuǎn)基因小鼠中,轉(zhuǎn)基因BNLF-1分別整合在不同的染色體上,推測轉(zhuǎn)基因原代鼠的轉(zhuǎn)基因整合可能是隨機的多位點整合。佴文惠等利用FISH技術(shù)用人9號、14號染色體探針對低溫和長期傳代的黑葉猴細胞株(是由EB病毒體外轉(zhuǎn)化黑葉猴外周淋巴母細胞獲得的傳代細胞株,建株后經(jīng)檢查確定黑葉猴細胞株核型正常)染色體畸變進行分析,發(fā)現(xiàn)一些黑葉猴細胞在12和17號染色體之間發(fā)生了易位,一條17號染色體在17q13處斷裂,斷裂片段17q13-17qter易位到一條12號染色體長臂末端,形成一條小的中著絲粒和一條具較長長臂的衍生染色體即der(17)和der(12)。此結(jié)果表明,熒光原位雜交技術(shù)用人染色體特異性探針不僅能檢測出人類染色體畸變,也能有效地檢測靈長類動物染色體畸變。2.3染色體fish技術(shù)由于FISH技術(shù)在核型分析上具有的優(yōu)越性,越來越廣泛地應(yīng)用于產(chǎn)前診斷方面。黃浩杰等用G顯帶染色體FISH技術(shù)研究一習(xí)慣性流產(chǎn)女患者46,XX,t(1;5;12)(1pter→1q23::12q22→12qter;5qter→5p11::1q25→1qter;12pter12q22::1q23→1q25::5p11→5pter),為其產(chǎn)前診斷提供了條件,并對常規(guī)G帶染色體FISH技術(shù)提出了改進方法。崔英霞等用染色體特異性探針與中期染色體雜交技術(shù),分析診斷了3例患者(表型正常臨床上僅表現(xiàn)為流產(chǎn)、分娩畸形兒)平衡易位的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)染色體的易位發(fā)生位置與胚胎的存亡具有某種相關(guān)性。因此對這部分病人尤其要重視產(chǎn)前診斷。傅俊江等用FISH技術(shù)研究了一罕見的復(fù)雜易位男性攜帶者,對其進行了染色體繪畫研究,確定其核型為46,XY,-7,-8,-9,+der(7)t(7;9)(q2200;p24),+der(8)inv.ins(8;7)(q2100;q31.2q2200),+der(9)t(9;7)(p24;q31.2)ishder(7)t(7;9)(wcp7+),der(8)inv.ins(8;7)(wcp7+,wcp8+),der(9)t(9;7)(wcp7+)。3突變的染色體上基因定位和