微生物生態(tài)學(xué)研究的現(xiàn)狀與展望

微生物生態(tài)學(xué)研究的現(xiàn)狀與展望

微生物是地球生物圈的重要組成部分。研究自然界中微生物的生物多樣性和微生物種群之間的相互作用以及測定自然界中微生物的活動并且監(jiān)測它們對生態(tài)系統(tǒng)的影響是微生物生態(tài)學(xué)的主要任務(wù)。當(dāng)前,許多涉及國計(jì)民生的重大理論問題的解決都需要微生物生態(tài)學(xué)知識的應(yīng)用。盡管近十幾年來,由于分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,微生物生態(tài)學(xué)的研究深度及廣度有所增加,但還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的發(fā)展和全球氣候變化的影響,許多有用的微生物資源正在消失,這更增強(qiáng)了人們希望客觀真實(shí)的認(rèn)識微生物生態(tài)的迫切性。鑒定和監(jiān)測微生物是微生物生態(tài)學(xué)研究的重要內(nèi)容之一。其方法主要有以下幾種:①顯微鏡檢測。顯微鏡技術(shù)快速廉價,可以直接觀察和大致分辨微生物,但是由于缺乏形態(tài)學(xué)方面的指標(biāo)而不易得到可靠的結(jié)果。②微生物培養(yǎng)。培養(yǎng)的方法周期長,不適用于難培養(yǎng)的微生物,而且不能反映自然環(huán)境中微生物群落組成和多樣性。③分子生物學(xué)檢測。最近幾年,數(shù)種分子標(biāo)記方法如SSR、ISSR、AFLP、RAPD、SSCP和DGGE等的應(yīng)用為研究微生物種群和鑒定微生物提供了新的途徑。但是,這些基于PCR的方法可能會在擴(kuò)增反應(yīng)中引入誤差,降低了所得信息的精確度。熒光原位雜交(FISH)技術(shù)作為一種不依賴PCR的分子分析技術(shù)是以上各種分子標(biāo)記技術(shù)的有益補(bǔ)充,并同時提供形態(tài)學(xué)、數(shù)量、空間分布與細(xì)胞環(huán)境方面的信息,使人們可以對自然生境中的微生物進(jìn)行動態(tài)地觀察和鑒定。1fish技術(shù)在微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用FISH技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、原位等諸多優(yōu)點(diǎn),故目前已成為微生物生態(tài)學(xué)各個領(lǐng)域研究中強(qiáng)有力的工具。1.1對微生物多樣性的研究環(huán)境中存在的微生物品種和數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過已鑒定的微生物。在很長的一段時期內(nèi),微生物多樣性的重要性未引起人們的重視?；趓RNA的分析技術(shù)改變了微生物種群結(jié)構(gòu)描述困難的現(xiàn)狀。但是,大部分的技術(shù)例如核酸抽提和PCR擴(kuò)增都有一定程度的偏差。FISH技術(shù)可以將整體微生物環(huán)境清晰的呈像出來而不需要額外的抽提和擴(kuò)增等易引起偏差的步驟。所以,FISH技術(shù)被廣泛應(yīng)用于環(huán)境微生物多樣性的研究,例如水生環(huán)境中的微生物種群研究。SimonNathalie,BiegalaIsabelle等在2002年利用FISH技術(shù)研究海水中細(xì)菌和有害藻類種群之間的相互作用。ArayaRuben;TaniKatsuji等在2003年對溪流中和水中生物膜上的微生物群落進(jìn)行了FISH研究。FISH技術(shù)不僅提供靜止的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,還可以動態(tài)地觀察流動水體中的微生物種群變化,可以檢測季節(jié)更替對高山湖泊中微生物群落的影響。LiuJ,LeffLG在2002年利用此技術(shù)監(jiān)測了河流中微生物群落的動態(tài)變化。利用FISH技術(shù)得到了一些在人工條件下很難培養(yǎng)的菌種以及一些新的菌種信息。GirguisPR,DelongEF在2002年用厭氧富集的方法從深海沉積物中培養(yǎng)到一些古菌,隨后使用FISH技術(shù)對這些古菌進(jìn)行了鑒定。McnamaraChristopherJ,LemkeMichaelJ,LeffLauraG利用FISH技術(shù)對美國卡羅萊納州南部溪流沉積物中可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的細(xì)菌群落進(jìn)行了分析。所有這些研究對于人們理解環(huán)境中微生物種群的組成和動力學(xué)都有極大的重要性。1.2基于rna的fish技術(shù)致活性污泥Ardern和Lockett在1914年發(fā)明了活性污泥法處理污水。但是直到今天微生物種群在此工藝中的作用還沒有完全了解清楚。培養(yǎng)的方法選擇性強(qiáng),不能提供可靠的信息。基于rRNA的FISH技術(shù)開始使人們逐漸摸清了微生物的作用機(jī)理。LeeTJ等在2002年利用FISH技術(shù)研究了活性污泥中聚磷酸鹽積累型細(xì)菌(PABs)和糖原積累型細(xì)菌(GABs)的數(shù)量和空間分布。CoskunerG,CurtisTP于2002年用FISH技術(shù)原位鑒定了活性污泥中硝化細(xì)菌群落的組成和分布,為理解污水處理中氮素循環(huán)提供了重要的信息。1.3原位雜交的原理大部分的內(nèi)共生微生物是難于培養(yǎng)的。利用16SrRNA技術(shù),它們可以被鑒定和系統(tǒng)分類。在原生動物和真核細(xì)胞生物中有很多攝食泡或腸內(nèi)的微生物不易和真正的內(nèi)共生微生物區(qū)分。利用FISH技術(shù)的原位雜交原理可以對它們進(jìn)行鑒別。PeraudO,YousafM,HamanaMT等于2002年對海綿體中微生物種群進(jìn)行的分析,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生抗瘧疾化合物ManzamineA的海綿可能僅僅只是真正產(chǎn)此化合物微生物的宿主。1.4fish技術(shù)在醫(yī)學(xué)微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用1.4.1fish技術(shù)的應(yīng)用(1)口腔中的微生物已經(jīng)證明,FISH技術(shù)是分析正常的微生物群落和混合細(xì)菌感染的強(qiáng)有力的工具。利用FISH技術(shù)檢測到在人類口腔中有300余種不同的細(xì)菌,其中大多數(shù)是很難培養(yǎng)或根本不能培養(yǎng)的品種?？谇患膊?如牙根骨膜炎和牙齦炎等都和相應(yīng)的細(xì)菌群有關(guān)。BrinigMaryM;LeppPaulW;OuverneyCleberC等在2003年通過FISH技術(shù)研究了難于培養(yǎng)的TM7細(xì)菌在人類口腔中的分布和傳染機(jī)理。2003年FosterJamieS;PalmerRobertJ等通過FISH技術(shù)以人類口腔細(xì)菌群落為模型研究了基因?qū)蛳嗷プ饔?genome-genomeinteractions)。(2)胃腸菌群腸胃是微生物在人體最大的定居和活動場所,所以研究正常健康的腸胃菌群和其形成的生物膜是非常重要的。同樣的,用常規(guī)的培養(yǎng)方法會低估微生物的數(shù)量和種類。SwidsinskiAlexander;LadhoffAxel等于2002年利用FISH技術(shù)研究了腸炎患者的腸粘膜菌群,發(fā)現(xiàn)隨著病人疾病程度的加重,其腸粘膜上的菌群密度也增大。2002年ZoetendalErwinG;Ben-AmorKaouther等利用FISH技術(shù)對人類糞便中難于培養(yǎng)的卵胃球菌樣細(xì)菌(Ruminococcusobeum-likebacteria)進(jìn)行了鑒定和計(jì)數(shù),發(fā)現(xiàn)此類細(xì)菌是人類糞便中極其重要的組成部分。(3)呼吸道菌群社區(qū)獲得性肺炎是近年來開始流行的嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)疾病。BuccatA;JuretschkoS等于2002年利用FISH技術(shù)對能夠引起社區(qū)獲得性肺炎的病原體進(jìn)行了快速鑒定。軍團(tuán)菌病也是一種較嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)流行病。2002年BuchbinderSusanne;TrebesiusKarlheinz等利用FISH技術(shù)對32份來自醫(yī)療單位的水樣和68份來自普通家庭的水樣中的軍團(tuán)菌(Legionellaspp.)進(jìn)行了鑒定。2照明技術(shù)的發(fā)展過程、原理和常用的fish技術(shù)介紹2.1熒光探針技術(shù)特點(diǎn)熒光原位雜交技術(shù)由原位雜交技術(shù)(InsituHybridizationISH)發(fā)展而來,其間經(jīng)歷了放射性標(biāo)記探針階段和熒光標(biāo)記探針階段,Pardue、Gall、John、Giovannoni和DeLong等的研究工作為此項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展做出了貢獻(xiàn)[18,19,20,21,22,23]。與放射性探針相比,熒光探針具有以下優(yōu)點(diǎn):①安全;②分辨率好且不需要額外的檢測步驟;③熒光探針可以用發(fā)射不同波長的染料標(biāo)記,從而在一個檢測步驟中可同時處理多條目標(biāo)序列。最近10a,迅速而敏感的FISH技術(shù)已經(jīng)成為微生物系統(tǒng)發(fā)育、微生物生態(tài)學(xué)、傳染病和醫(yī)學(xué)診斷以及環(huán)境微生物研究中強(qiáng)有力的分析工具。2.2細(xì)胞內(nèi)互補(bǔ)核酸序列及樣品制備熒光原位雜交是指通過熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針特異地和互補(bǔ)核酸序列在完整的細(xì)胞內(nèi)結(jié)合。具體過程包括以下幾步:①固定標(biāo)本;②預(yù)處理樣品;③用相應(yīng)的探針進(jìn)行雜交;④洗掉未結(jié)合的探針;⑤封固、呈像及結(jié)果分析。2.2.1使用mosome方法的探針設(shè)計(jì)和選擇探針要考慮探針的特異性、敏感性以及組織穿透力。一個典型的探針長度應(yīng)在15～30bp左右。短探針較容易接近目標(biāo)序列,但相應(yīng)攜帶熒光染料的能力降低。常用的探針可分3類:(1)染色體特異重復(fù)序列探針(probetochromosome-specificrepeatedsequence)。像α衛(wèi)星、衛(wèi)星Ⅲ類的探針,它們的雜交靶位常大于1Mb,不含散在重復(fù)序列,與靶位結(jié)合緊密,雜交信號強(qiáng),易于檢測,常用于監(jiān)測細(xì)胞間期非整倍染色體。(2)全染色體或染色體區(qū)域特異性探針(whole-chromosomeorchromosomeregion-specificprobes)。由一條染色體或其上某一區(qū)域特異性高的核酸片段組成,可由克隆到噬菌體或粘粒上的染色體特異性大片段文庫制取。這類探針可用于中期染色體重組和間期核型分析。(3)特異位置探針(specific-locusprobe)。這種探針通常由一個或幾個克隆序列組成,可由特定DNA大片段的分子克隆或cDNA克隆制取,主要用來進(jìn)行基因克隆、DNA序列定位和檢測靶DNA序列拷貝數(shù)及其結(jié)構(gòu)的變化?，F(xiàn)將一些探針序列列于表1中供參考。標(biāo)記探針有直接標(biāo)記和間接標(biāo)記兩種。直接熒光標(biāo)記法有兩種方式,一種方式是用化學(xué)合成的方法將一個或多個熒光染料分子以氨基連接于寡核苷酸的5’端。另一種是用末端轉(zhuǎn)移酶將熒光標(biāo)記的核苷酸連接于寡核苷酸的3’端。通過中間物將異硫氰酸熒光素(Fluorescein-IsothiocyanateFITC)偶聯(lián)于寡核苷酸可增加信號強(qiáng)度。同時在寡核酸兩端進(jìn)行標(biāo)記也可增加信號強(qiáng)度。一般是在3’端加一個熒光分子,在5’端加4個熒光分子,在此4個熒光分子間以適當(dāng)?shù)拈g隔物如寡核苷酸等分開防止熒光的淬滅。間接標(biāo)記法是將地高辛或生物素等和探針結(jié)合,然后用熒光抗地高辛抗體或熒光抗生物素抗體檢測。FISH的敏感性可通過酶促信號放大而得到提高。例如將地高辛抗體和堿性磷酸酶偶聯(lián)來檢測地高辛標(biāo)記的寡核苷酸鏈,其信號強(qiáng)度是單熒光分子標(biāo)記法的8倍;用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記寡核苷酸,以熒光標(biāo)記的酪胺為底物的酪胺信號放大技術(shù)(TyramideSignalAmplificationTSA)可以提高信號強(qiáng)度10～20倍。目前最敏感的方法是用多種熒光分子進(jìn)行標(biāo)記同時結(jié)合TSA信號放大系統(tǒng)。此方法已成功的用于李斯特氏菌毒力因子檢測。2.2.2染料的選擇用具有不同波長的熒光染料可同時檢測兩種或多種微生物。應(yīng)用染料的原則是:最明亮的染料要用來檢測豐度最低的對象。微生物研究中常用的熒光染料見表2。2.2.3基本食物操作[35、36、37、38、39和40]制作樣品的玻片首先要用覆膜劑處理,這樣可以使樣品更好的和玻片結(jié)合。常用的覆膜劑有明膠、聚-L-賴氨酸以及硅烷等。(1)-glutraldhsyde的制備常用的固定液有,FAA(Formalin-AceticAcid);Paraformaldehyde(低聚甲醛);Glutaraldehyde(戊二醛)。配100mlFAA固定液,其組分為:Ethanol50ml,AceticAcid5ml,37%Formaldehyde10ml,DEPC-H2O35ml。(2)脫水脫水采用梯度脫水法,用8個梯度依次脫水,自然干燥,最后到100%叔丁醇(表3)。(3)parag企業(yè)的微波處理psb①HCl處理和ProteinaseK消化,將樣品在0.2MHCl中室溫處理20min然后浸入H2O中2min終止反應(yīng)。37℃下,2XSSC中,浸泡30min。配新鮮的ProteinaseK母液20mg/ml,取2.5μl加入50ml的ProteinaseKSolution(多加至沒過載片的頂部,將整張片子進(jìn)行Rnase處理)中,終濃度為1μg/ml,37℃溫育30min。加入含2mg/mlGlycine的PBS中,室溫處理2min終止反應(yīng)。②再固定和脫水,新配制40mg/mlParaformaldehyde/PBS,微波爐中(50℃)加熱助溶冷至室溫后使用,將樣品浸入其中處理20min固定。浸入1XPBS中處理2次,每次5min。新配制1ml/LAceticAnhydride(醋酸酐)溶于0.1mol/LTEA(三乙醇胺)。將樣品浸入其中室溫下處理10min,期間不斷輕搖。浸入1XPBS中處理2次,每次5min。乙醇梯度脫水,H2O,15%,30%,50%,70%,85%,95%,100%。自然干燥后待雜交。③雜交,雜交液用前充分振蕩。將探針加到雜交液中,濃度為400～800ng/ml。預(yù)熱雜交液至45℃,提前打開42℃培養(yǎng)箱,預(yù)熱濕盒。每個片子涂40μl,輕輕蓋一片等大的方形蓋片,兩端堵上截短的載片,蓋上大載片,形成一小室,用parafilm封緊邊緣。將載片放于濕盒中,42℃過夜。將玻片放入37℃2×SSC的冰盒中,漂去蓋片,再洗脫。(4)rnase載片制備①洗脫,首先37℃下在染色缸中用2XSSC洗2×15min,然后37℃下在染色缸中用1×SSC洗2×15min。②Rnase處理,40μl20mg/mlRnase儲液加入到40mlNTE中(終濃度20μg/ml),放入載片,37℃溫育30min。37℃下用0.5XSSC洗2X15min。放入PBS中,4℃過夜或直接進(jìn)行檢測。2.3h的ssr特性以上簡單介紹了FISH技術(shù)的基本原理和操作,在此基礎(chǔ)上,FISH技術(shù)逐漸形成了從單色到多色、從中期染色體到粗線期染色體再向DNA纖維的發(fā)展趨勢,靈敏度和分辨率正在由mb向kb、百分距離向堿基對、多拷貝向單拷貝、大片段向小片段再向BAC/YAC等方向深入。2.3.1玻片法雜交定位FISH可利用不同顏色的熒光染料標(biāo)記不同的探針,同時對一張玻片進(jìn)行雜交,從而同時檢測和定位不同的靶DNA,即mFISH。由于不同的熒光素之間可能發(fā)生光譜的重疊,故