大鼠骨質(zhì)疏松模型的建立

大鼠骨質(zhì)疏松模型的建立

隨著老年人口的增加，骨質(zhì)疏松癥已成為老年人面臨的主要疾病之一，骨質(zhì)疏松癥的治療和預(yù)防研究日益受到重視。如何選擇合適的骨骼松弛動(dòng)物模型是方法學(xué)和實(shí)驗(yàn)條件的基礎(chǔ)。目前，最基本、最經(jīng)濟(jì)的治療骨質(zhì)疏松癥的方法仍然是鈣營養(yǎng)療法，通過營養(yǎng)控制建立更接近自然狀態(tài)的大鼠骨骼松弛模型。作者試圖在飼料中結(jié)合不同比例的鈣和蛋白質(zhì)，以建立適合大鼠骨骼松弛的動(dòng)物模型。1材料和方法1.1動(dòng)物21日齡雌性清潔級(jí)Wistar大鼠,體重38～40g,復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供(合格證號(hào)02-22-4)。1.2i-bgp試驗(yàn)酪蛋白上海乳品二廠生產(chǎn);碳酸鈣上海泗聯(lián)化工廠生產(chǎn);99mTC-MDP上海醫(yī)科大學(xué)紅旗制藥廠生產(chǎn);125I-BGP試劑盒,解放軍總醫(yī)院長城免疫技術(shù)研究所生產(chǎn),靈敏度<0.22μg/L;125I-E2試劑盒,天津DPC生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司生產(chǎn),靈敏度5ng/L。1.3材料、儀器和儀器SPA型單光子大鼠骨密度儀,中國測(cè)試技術(shù)研究院裝置,放射源為125I,精密度為2%;DPX-L型雙能X線骨密度儀,美國LUNAR公司生產(chǎn),能譜38/Takev,高壓穩(wěn)定±0.05%,儀器精密度1%。附動(dòng)物全身骨密度測(cè)定軟件;Elscientsp-6型SPECT,附針孔準(zhǔn)直器及低能高分辨率準(zhǔn)直器;PE-3110型原子吸收分光光度計(jì);島津萬能材料測(cè)試儀,AG-20N型;HITACH-7110型全自動(dòng)生化儀。1.4飼養(yǎng)及蛋白質(zhì)40只大鼠按體重隨機(jī)分成5組,第一組為對(duì)照組,2～5組為實(shí)驗(yàn)組,組間體重差別小于1g,不銹鋼籠單籠飼養(yǎng),自由飲水,飼喂不同蛋白質(zhì),鈣含量水平的全價(jià)合成飼料見表1。參照AOAC建議方法進(jìn)行飼料配方。1.5生長試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)第1周至第7周每周稱量體重2次。實(shí)驗(yàn)第8至20周每周稱重1次,記錄體重增長。1.6巴比妥鈉的應(yīng)用大鼠稱重,以50mg/kg體重腹腔注射戊巴比妥鈉,動(dòng)物麻醉后置于DPX-L密度儀探頭下,應(yīng)用動(dòng)物全身骨密度測(cè)定軟件作全身掃描,圖象顯示在熒光屏上,并自動(dòng)打印測(cè)定結(jié)果。1.7戊巴比妥鈉tc-mdp實(shí)驗(yàn)結(jié)束前一周,以玻璃固定器固定大鼠,暴露鼠尾,在離鼠尾根3cm處用酒精棉球擦拭數(shù)遍,并用手術(shù)反光燈(60W)照射尾部。使其尾靜脈充盈,用1ml針筒準(zhǔn)確吸取30MBq的99mTc-MDP靜脈注入。3h后,以50mg/kg體重腹腔注射戊巴比妥鈉。動(dòng)物麻醉后,俯臥固定在解剖臺(tái)上,放在配有低能高分辨準(zhǔn)直器的SPECT探頭下,采集矩陣128×128,采集計(jì)數(shù)150K數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算機(jī)自動(dòng)處理,骨掃描圖像顯示于熒光屏。1.8血清p、me大鼠麻醉后取股動(dòng)脈血,使用甲基麝香酚蘭測(cè)血清Ca,直接測(cè)定法測(cè)定血清P、血清Mg,對(duì)硝基苯磷酸二鈉速率法測(cè)定血清AKP含量。125I-BGP試劑盒測(cè)血清BGP含量,125I-E2試劑盒測(cè)血清E2含量。1.9測(cè)定的液體生化值實(shí)驗(yàn)結(jié)束前,用代謝籠收集大鼠24h尿液。使用EDTA直接滴定法測(cè)尿鈣,茚三酮法測(cè)尿羥脯氨酸。1.10數(shù)據(jù)分析和方法動(dòng)物處死后,取右側(cè)股骨去盡肌肉及韌帶組織,稱濕重。用千分卡測(cè)量股骨長。然后在2份三氯甲烷和1份甲醇混合液中脫脂72h后,置120℃烘箱烤1h,股骨稱重即為去脂干重。再根據(jù)阿基米德定律測(cè)股骨體積。把股骨置坩堝炭化后放入Muffer爐中800℃灰化6h,測(cè)得股骨的礦物質(zhì)含量。最后用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)骨鈣。左側(cè)股骨去除附著的肌肉和結(jié)締組織,安置在裝有蒸餾水的有機(jī)玻璃盒支架上,以全長的二分之一交界處為測(cè)量點(diǎn),應(yīng)用SPA單光子骨密度儀作骨橫越掃描,測(cè)出值即為股骨骨密度。然后用AG-20N島津萬能材料測(cè)試儀(跨越10mm,速度為5mm/min),分別測(cè)定并記錄最大承受值和骨折時(shí)的強(qiáng)度,骨折時(shí)的力學(xué)強(qiáng)度即為股骨抗彎力強(qiáng)度。1.11骨組織病理學(xué)檢測(cè)處死動(dòng)物后,取右側(cè)脛骨和第三腰椎,去除附著的肌肉和結(jié)締組織,用10%福爾馬林固定,常規(guī)脫鈣,石蠟包埋切片,HE染色,光鏡下觀察骨組織病理學(xué)改變。1.12數(shù)據(jù)處理和分析全部數(shù)據(jù)均經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,采用方差分析和t檢驗(yàn)方法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1周起至第20周實(shí)驗(yàn)情況低蛋白低鈣和低蛋白中等鈣兩組分別和對(duì)照組比,從實(shí)驗(yàn)第2周起至第20周實(shí)驗(yàn)結(jié)束,體重差異極顯著(P<0.001)。高蛋白低鈣組與對(duì)照組相比僅在實(shí)驗(yàn)結(jié)束的第20周,即終體重偏小,動(dòng)物生長發(fā)育狀況優(yōu)于低蛋白低鈣(表2)。2.2密度差異的分析高蛋白低鈣和低蛋白低鈣組動(dòng)物全身骨密度和股骨骨密度分別與對(duì)照組相比,差異極顯著(P<0.001)。低蛋白中等鈣組動(dòng)物全身骨密度與對(duì)照組相比,差異有顯著性(P<0.05)(表3)。2.3總體壓的比較見表1高蛋白低鈣和低蛋白低鈣組動(dòng)物股骨濕重、長度、體積均小于對(duì)照組,差異有顯著性(P<0.05)。高蛋白普通鈣組動(dòng)物股骨濕重高于對(duì)照組,差異極顯著(P<0.001)(表4)。2.4低蛋白普通鈣對(duì)大鼠骨鈣量的影響高蛋白低鈣和低蛋白低鈣組動(dòng)物的抗彎力強(qiáng)度、去脂干重、灰重、骨鈣含量分別與對(duì)照組相比,差異極其顯著(P<0.001)。低蛋白普通鈣組動(dòng)物的抗彎力強(qiáng)度、去脂干重、骨鈣含量與對(duì)照組相比,差異均有顯著性(P<0.01)。高蛋白普通鈣組動(dòng)物的去脂干重、灰重、骨鈣含量均高于對(duì)照組,差異有顯著性(P<0.05)(表5)。2.5血清鈣、白低鈣、血清磷、各指標(biāo)血清鈣和血清鎂均以對(duì)照組為最高,低鈣組包括高蛋白低鈣和低蛋白低鈣為最低。血清磷以高蛋白普通鈣組為最高,高蛋白低鈣組為最低。血清AKP以高蛋白普通鈣組為最低,低蛋白組包括低蛋白低鈣和低蛋白普通鈣組為最高,但以上比較均無顯著性(表6)。2.6鈣、尿中氨基酸含量詳見表7。2.7對(duì)比兩組患者的血清p>0.0.0高(低)蛋白、低鈣兩組動(dòng)物的BGP含量明顯低于對(duì)照組,差異極顯著(P<0.01)。高(低)蛋白、低鈣兩組動(dòng)物的E2水平也較低,與對(duì)照組相比差異有顯著性(P<0.05)(表8)。2.8斯皮爾曼的結(jié)果低蛋白低鈣組的放射計(jì)數(shù)明顯高于其余各組,而高蛋白中等鈣組的計(jì)數(shù)最少。高蛋白低鈣動(dòng)物的計(jì)數(shù)也較少(表9)。2.9骨小梁表面類生根低蛋白低鈣和高蛋白低鈣組大鼠骨小梁細(xì)小,疏松排列,骨髓腔相對(duì)變寬,骨小梁表面類骨質(zhì)增生不明顯(第195頁圖1、2)。對(duì)照組動(dòng)物骨小梁明顯粗大,排列緊密,骨髓腔相對(duì)變窄。骨小梁表面類骨質(zhì)增生明顯(第195頁圖3)。3蛋白質(zhì)穩(wěn)定的檢測(cè)骨質(zhì)疏松是以骨量減少,骨組織顯微結(jié)構(gòu)改變和骨折危險(xiǎn)頻度增加的疾病。形成骨質(zhì)疏松可有以下四種表現(xiàn)。骨礦物質(zhì)和骨基質(zhì)等比例的減少;由于骨礦物質(zhì)的減少,所以骨骼正常荷載功能發(fā)生變化,在不致發(fā)生骨折的外力作用下也可發(fā)生骨折;在X線照片上,光鏡病理片和電鏡下及骨形態(tài)計(jì)量學(xué)方法都可以發(fā)現(xiàn)骨組織的結(jié)構(gòu)和量發(fā)生變化;用各種骨密度測(cè)量法、生物化學(xué)檢測(cè)法都可為診斷骨質(zhì)疏松癥和鑒別診斷提供重要的參數(shù)。當(dāng)機(jī)體處于鈣邊緣缺乏狀態(tài)時(shí),即當(dāng)我們給予低鈣(0.025%)膳食時(shí),尿鈣和糞鈣減少有利于鈣存留,可抑制骨鈣動(dòng)員,但機(jī)體對(duì)低鈣攝入的適應(yīng)能力有一定限度,當(dāng)長期飼育極低鈣膳食時(shí),機(jī)體也就不得不排除該排出鈣,即為鈣的強(qiáng)制性排出,鈣來源于骨骼,所以骨質(zhì)疏松大鼠組的骨鈣含量低。高蛋白攝入使腎小球鈣濾過率上升尿鈣排出增加。同時(shí)高蛋白攝入也使蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物固定酸的含量上升,腎近曲小管鈣重吸收能力下降,也可引起尿鈣升高。高蛋白攝入激發(fā)了胰島素與胰島素樣生長因子(2GF-1)的調(diào)節(jié)作用。研究表明,膳食蛋白質(zhì)加倍,尿鈣增加50%,動(dòng)物蛋白質(zhì)(如酪蛋白)的高鈣尿效應(yīng)大于植物蛋白質(zhì)(如大豆蛋白)、含硫氨基酸的高鈣尿效應(yīng)大于非含硫氨基酸。人群中蛋白質(zhì)攝入量與股骨上端骨折發(fā)病率顯著相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中低蛋白低鈣組大鼠雖然骨質(zhì)疏松指標(biāo)與對(duì)照組差異極顯著,但這組動(dòng)物生長極緩慢,成年體重極低,飼料效價(jià)低,可能有不可控制的因素導(dǎo)入模型。而高蛋白低鈣組動(dòng)物生長良好,外觀和對(duì)照組大鼠一致,其股骨骨密度,股骨體積,股骨濕重,股骨去脂干重,股骨灰重,股骨抗彎力強(qiáng)度分別與對(duì)照組相比,差異均極顯著(P<0.01)。符合骨質(zhì)疏松的特征即骨量(骨灰重、骨鈣含量、骨密度)的明顯減少。股骨的濕重,去脂干重、灰重、骨鈣含量數(shù)據(jù)之間具有高度相關(guān)性,說明本試驗(yàn)對(duì)股骨的處理得當(dāng)。值得一提的是,在本試驗(yàn)采用的骨質(zhì)元素樣品制備條件(去脂股骨在坩堝電爐上炭化后放入Muffer爐中800℃灰化6h)下,不能用PE-3110型原子吸收分光光度計(jì)測(cè)出Mn、Mg、Cu、Zn、Fe等微量元素。這可能與灰化溫度過高有關(guān)。高溫致使的樣品揮發(fā)對(duì)含量在30%以上的鈣影響不大,但對(duì)其他微量元素卻有著較大影響,有文獻(xiàn)報(bào)道,溫度應(yīng)控制在450℃,24h灰化。高蛋白低鈣組骨質(zhì)疏松模型動(dòng)物血清鈣、血清磷、血清鎂和血清堿性磷酸酶含量,其變化雖有規(guī)律但與對(duì)照組比較差異均無顯著性,這可能與機(jī)體會(huì)通過一系列適應(yīng)性反應(yīng)來維持骨量有關(guān),如低鈣攝入使血PTH升高,然后腎細(xì)胞中磷含量增高,腎1α-羥化酶活性上升,腎近曲小管1,25(OH)2D3合成加快,小腸上段鈣主動(dòng)吸收加快,糞鈣減少,最終使血鈣又回升。本次研究結(jié)果提示:骨質(zhì)疏松模型動(dòng)物BGP水平明顯低于對(duì)照組,說明高蛋白低鈣組大鼠骨轉(zhuǎn)換或骨形成能力低下。尤其值得注意的是,當(dāng)BGP低于正常時(shí),其血清鈣、磷、鎂和AKP值與對(duì)照組無差異(P>0.05)。由此可見,血清BGP與BMD一樣對(duì)骨形成和骨轉(zhuǎn)換變化的反映較血鈣,血磷、血鎂,血AKP反映更為敏感可靠。雌二醇對(duì)骨的主要作用是抑制骨吸收。本實(shí)驗(yàn)中骨質(zhì)疏松模型動(dòng)物的E2值偏低,使骨吸收加快。高蛋白低鈣骨質(zhì)疏松模型動(dòng)物尿鈣,尿羥脯氨酸的含量均高于對(duì)照組(P<0.001)。高蛋白和極低鈣膳食均促使大鼠鈣的強(qiáng)制性排出。當(dāng)大鼠處于骨轉(zhuǎn)換的負(fù)平衡時(shí),還可引起骨的膠原蛋白代謝異常,促進(jìn)尿HOP的排泄增加,從而導(dǎo)致骨韌性降低,脆性增加。結(jié)果提示:尿鈣及尿羥脯氨酸的測(cè)定須收集24小時(shí)尿,能夠比較準(zhǔn)確反應(yīng)機(jī)體鈣HOP的排出水平?？蓱?yīng)用空腹晨尿測(cè)尿Ca和尿肌肝比值(Ca/Cr)。雖然報(bào)道人體采用此法,靈敏準(zhǔn)確,不受尿量硬響。但對(duì)于大鼠卻存在尿量少,無法排除夜間尿和晨濃縮尿。所以,大鼠尿樣的采集正確與否,直接影響著尿液生化結(jié)果的準(zhǔn)確性。高蛋白低鈣骨質(zhì)疏松模型大鼠全身骨密度測(cè)定和SPECT全身骨顯像,均在動(dòng)物活體進(jìn)行,和人體的防病、治病,藥物療效等方面應(yīng)用,有良好的對(duì)比性。SPECT的圖像觀察比較直觀,并在活體上反映了骨代謝狀況。高蛋白低鈣骨質(zhì)疏松模型大鼠骨組織病理發(fā)現(xiàn)大鼠骨小梁細(xì)小,疏松排列,骨髓腔相對(duì)變寬,骨小梁表面類骨質(zhì)增生不明顯。有文獻(xiàn)報(bào)道幼鼠缺鈣所致病變可是骨質(zhì)疏松癥,或是佝僂病。青春期鈣攝入不足對(duì)峰狀骨質(zhì)會(huì)產(chǎn)生不可逆的有害影響。在幼鼠,影響骨量的最主要的