轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)原理及應(yīng)用課件

RNA測序技術(shù)原理及應(yīng)用RNA測序技術(shù)原理及應(yīng)用1遺傳的中心法則基因組—轉(zhuǎn)錄組—表觀遺傳組—蛋白組層次遺傳的中心法則基因組—轉(zhuǎn)錄組—表觀遺傳組—蛋白組層次2什么是轉(zhuǎn)錄組？All

transcripts

All

mRNAs什么是轉(zhuǎn)錄組？All

transcriptsAll

m3RNA是解讀基因組的關(guān)鍵RNAProteinPhenotypeGenotype

DNARNA是解讀基因組的關(guān)鍵RNAProteinPhenotyp4測序技術(shù)RNA-SeqSmallRNA測序降解組測序Non-codingRNA測序研究對象mRNASmallRNAmRNANon-codingRNA鑒定新分子OOOO表達(dá)譜研究OOOO基因結(jié)構(gòu)分析O/XXXOEST測序O/XXXX

篩選分子標(biāo)記

OOOX轉(zhuǎn)錄融合基因表達(dá)O/XXXXRNA測序技術(shù)測序技術(shù)RNA-SeqSmallRNA降解組測序Non-c5WorkflowofRNA-Seq樣品檢測文庫制備ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析WorkflowofRNA-Seq樣品檢測6TotalRNA樣品檢測

Agilent2200檢測OD260/280:1.8~2.2RNA28S:18S≥1.0;RIN≥7

新型安捷倫2200TapeStation

系統(tǒng)是新一代測序（NGS）、生物微陣列芯片分析和qPCR工作流程以及蛋白質(zhì)純化和抗體生產(chǎn)過程中對生物樣品進(jìn)行質(zhì)量控制（QC）的理想解決方案。●

可擴(kuò)展的通量—16聯(lián)或96孔微量滴定板●

快速得到結(jié)果—平均每個樣品只需一分鐘便可獲得結(jié)果●

使用簡單—可直接使用的ScreenTape預(yù)制膠條簡化了工作流程●

樣品用量少—每次運行僅需要不到2ul樣品TotalRNA樣品檢測Agilent22007檢測報告-合格樣品棉鈴蟲/果蠅檢測報告-合格樣品棉鈴蟲/果蠅8檢測報告-不合格樣品檢測報告-不合格樣品9WorkflowofRNA-Seq樣品檢測文庫制備ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析WorkflowofRNA-Seq樣品檢測10真核mRNA的純化mRNA的純化主要通過的磁珠與生物素吸附原理從而分離純化Oligo（dT）25磁珠純化原理主要是mRNA的3′的polyA與磁珠在bindingbuffer的作用下相結(jié)合。磁珠通過MPC（磁分離器）從溶液中分離出來。mRNA與磁珠結(jié)合后，再用Tris-HCL在加熱條件下解離洗脫到溶液中。鏈霉親合素包被磁珠+生物素標(biāo)記Oligo（dT）25+poly（A）真核mRNA的純化mRNA的純化主要通過的磁珠與生物素吸附原11原核mRNA的純化AmbionMICROExpressKitLNA扣鎖型探針原核mRNA的純化AmbionMICROExpressK12mRNA反轉(zhuǎn)錄---fragment+RT純化過的mRNA樣品加入1μl的fragmentbuffer70℃作用1.5min。加入1μl的stopbuffer終止反應(yīng)。加入沉淀劑（NaAc糖原無水乙醇）沉淀產(chǎn)物。RTdscDNAmRNA反轉(zhuǎn)錄---fragment+RT純化過的mRNA樣13末端修復(fù)(防止自連）cDNA3′末端加AAdapter連接末端修復(fù)(防止自連）14第一天消化DNAmRNA的分離mRNA的打斷cDNA的合成↓↓第二天末端修復(fù)↓↓加接頭膠回收3’端加A第三天PCRPCR膠回收↓↓文庫制備↓↓文庫質(zhì)量檢測：Aligent2100：片段大小、純度、濃度qPCR：片段大小、濃度手工檢測：跑膠驗證。第一天消化DNAmRNA的分離mRNA的打斷cDNA的合成↓15WorkflowofRNA-Seq樣品檢測文庫制備ClusterStationIlluminaSequencing生物信息分析WorkflowofRNA-Seq樣品檢測16ApplicationRNA-Seq(單端測序---Quantification)RNA-Seq

(雙端測序---Transcriptome)Expression-profiling√√AlternativeSplicing－√FusionGene－√SNPdetection－√HiSeq2500ApplicationsofRNA-Seq17ApplicationRNA-SeqRNA-SeqExpr17RNA-Seq(Transcriptome)RNA-Seq(Transcriptome)18WorkflowofRNA-Seq(Transcriptome)生物信息學(xué)分析WorkflowofRNA-Seq(Transcript19RNA-Seq(Transcriptome)CharacterizethetranscriptomeinunparalleleddetailTechnique220RNA-Seq(Denovotranscriptomeassembly)RNA-Seq(Transcriptomeresequencing)RNA-Seq(Transcriptome)Charact20RNA-Seq(Denovotranscriptomeassembly)文庫構(gòu)建測序組裝RNA-Seq文庫構(gòu)建測序組裝21Denovoassembleatranscriptome組裝流程Denovoassembleatranscripto22數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計及測序數(shù)據(jù)的成分和質(zhì)量評估組裝結(jié)果分析（Contig長度分布、Scaffold長度分布、Unigene長度分布）Unigene（transcript）功能注釋Unigene的GO分類Unigene代謝通路分析預(yù)測編碼蛋白框（CDS）Unigene表達(dá)差異分析（兩個或兩個以上樣品）Unigene在樣品間的差異GO分類（需兩個或兩個以上樣品）和Pathway富集性分析Denovoassemblytranscriptome信息分析主要內(nèi)容：數(shù)據(jù)產(chǎn)出統(tǒng)計及測序數(shù)據(jù)的成分和質(zhì)量評估Denovoass23Denovoassemblytranscriptome信息分析流程Denovoassemblytranscriptome24Unigenes的GO注釋Unigenes的GO注釋25Pathway分析Pathway分析26RNA-Seq(Transcriptomeresequencing)cDNA文庫構(gòu)建測序比對到參考序列RNA-SeqcDNA文庫構(gòu)建測序比對到參考序列27Transcriptomeresequencing比對流程Transcriptomeresequencing比對流程28比對統(tǒng)計基因表達(dá)注釋基因差異表達(dá)分析基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化可變剪接分析預(yù)測新轉(zhuǎn)錄本cSNP分析Transcriptomeresequencing信息分析主要內(nèi)容比對統(tǒng)計Transcriptomeresequencing29Transcriptomeresequencing信息分析流程Transcriptomeresequencing信息分析30應(yīng)用---優(yōu)化轉(zhuǎn)錄組注釋信息基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化可變剪接鑒定基因融合鑒定RNA水平SNP分析應(yīng)用---優(yōu)化轉(zhuǎn)錄組注釋信息基因結(jié)構(gòu)優(yōu)化31GenomicintergenicregionReadsclusterPairedReadsdistribution優(yōu)化基因結(jié)構(gòu)

鑒定新的轉(zhuǎn)錄本Paired-End(PE)ReadsReads比對到參考序列基因間區(qū)域GenomicintergenicregionRea32鑒定可變剪接（AlternativeSplicing）exon1exon2exon3exon1exon2exon3exon1exon3commonreadsjunctionreadsmRNA鑒定可變剪接（AlternativeSplicing）33鑒定基因融合PairedReadsSingleReadsGeneAGeneB鑒定基因融合PairedReadsSingleReads34分析RNA水平SNP轉(zhuǎn)錄組重測序比對軟件：SOAPDenovo轉(zhuǎn)錄組測序:組裝軟件：SoapDenovo比對軟件：SoapSNP分析RNA水平SNP轉(zhuǎn)錄組重測序比對軟件：SOAP3536轉(zhuǎn)錄組研究技術(shù)橫向比較TechnologyTilingArraycDNAorESTsequesingTranscriptomeSequencingPrincipleHybridizationSangersequencingNext-GensequencingResolutionFromseveralto100SinglebaseSinglebaseThroughputHighLowHighRelianceongenomicsequenceYesNoInsomecasesBackgroundnoiseHighLowLowApplicationSimutaneouslymaptranscribedregionsandgeneexpressionYesLimitedforexpressionYesDynamicrangetoquantifygeneexpressionlevelUptoafew-hundredfoldNotpractical>8,000-foldAbilitytodistinguishdifferentisoformsandallelicexpressionLimitedYesYes36轉(zhuǎn)錄組研究技術(shù)橫向比較TechnologyTiling36轉(zhuǎn)錄組測序的優(yōu)勢RNA測序與芯片檢測基因數(shù)比較RNA測序與芯片檢測基因的表達(dá)量分布Technique1轉(zhuǎn)錄組測序的優(yōu)勢RNA測序與芯片檢測基因數(shù)比較R37GenomeRes2010Case

實驗材料收集：

葉片，花序,果實,根時間點：0,4,8,12,16,20和24h將每個時間點采集的樣品均勻混合測序策略：

Illumina測序，1GdataGenomeRes2010Case實驗材料收集：381.Highlight2.Heat3.Cold4.Salt5.Drought抗逆相關(guān)可變剪接1.Highlight2.Heat339外包膜蛋白16(AT2G28900)Intron-retentionControlLowTemperatureResistance低溫脅迫相關(guān)的AS低溫脅迫下這個內(nèi)含子和對照相比被保留了下來，揭示了可變剪接有重要功能。外包膜蛋白16(AT2G28900)Intron-rete40AS調(diào)節(jié)機(jī)制CCA1生物鐘相關(guān)基因，例如調(diào)節(jié)氣孔的開關(guān)等AS調(diào)節(jié)機(jī)制CCA1生物鐘相關(guān)基因，例如調(diào)節(jié)氣孔的開關(guān)等41RNA-Seq單端測序（Quantification）等同于數(shù)字表達(dá)譜(DGE)RNA-Seq單端測序42WorkflowofRNA-Seq單端測序（Quantification）生物信息學(xué)分析WorkflowofRNA-Seq單端測序（Quanti43RNA-Seq單端測序（Quantification）生物信息分析內(nèi)容測序數(shù)據(jù)評估篩選差異表達(dá)基因表達(dá)模式聚類分析GO功能富集分析Pathway富集分析蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析RNA-Seq單端測序（Quantification）測序數(shù)44RNA-Seq單端測序（Quantification）信息分析流程RNA-Seq單端測序（Quantification）信息分45RNA-Seq與基因芯片優(yōu)缺點比較技術(shù)優(yōu)點缺點RNA-seq1）檢測基因數(shù)比基因芯片多25%2）定量準(zhǔn)，可重復(fù)性高（重復(fù)相關(guān)系數(shù)≥0.99）3）數(shù)字化信號，無背景噪音，無交叉雜交4）高、低豐度基因均可檢測5）不受研究物種限制，模式生物和非模式生物均可檢測6）數(shù)據(jù)可與時俱進(jìn)，即隨數(shù)據(jù)庫更新而更新7）具有較好的分析兼容性，數(shù)據(jù)格式與芯片相同，可與芯片的分析軟件兼容1）樣本要求量比基因芯片多2）數(shù)據(jù)量大，需要具備一定的生物信息分析基礎(chǔ)，才能更好的挖掘數(shù)據(jù)蘊(yùn)含的豐富信息基因芯片1）平臺應(yīng)用較早2）信息分析軟件較多3）有些平臺要求樣品量少1）檢測靈敏度較低、重復(fù)性差、檢測閾值較狹窄2）有背景噪音，假陽性率＞1%3）受物種限制，只能檢測部分模式生物4）受基因拷貝數(shù)限制，無法檢測出低豐度基因5）只能檢測已知轉(zhuǎn)錄本，無法檢測出新轉(zhuǎn)錄本6）受數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)所限，因探針依靠現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫或比較舊的版本的數(shù)據(jù)庫來設(shè)計的，可能出現(xiàn)注釋不準(zhǔn)確的情況RNA-Seq與基因芯片優(yōu)缺點比較技術(shù)優(yōu)點缺點1）檢測基因數(shù)46casePlantPhysiology2010取樣：

選取在成熟季節(jié)開花后

5,10,和15個星期葡萄分別代表葡萄果實成熟中的三個時期（postsetting,ve′raison和ripening）數(shù)據(jù)量：超過59Mreads數(shù)據(jù)，長度在36-44bp之間運用RNA-Seq技術(shù)對葡萄果實發(fā)育過程中復(fù)雜轉(zhuǎn)錄特征的研究。casePlantPhysiology2010取樣：47表二reads在基因組上的分布情況表一

測序數(shù)據(jù)葡萄RNA-Seq單端測序表二reads在基因組上的分布情況表一測序數(shù)據(jù)葡萄R48漿果發(fā)育三個階段共有、特有基因表達(dá)分布圖基因表達(dá)量分布漿果發(fā)育三個階段共有、特有基因表達(dá)分布圖基因表達(dá)量分布49表達(dá)簇的分類分布情況差異表達(dá)的基因GO功能注釋---分成了19個功能類群---按照基因在三個不同時期的表達(dá)趨勢進(jìn)行分類，分成8個cluster。將基因的表達(dá)和它調(diào)控的一個生理功能聯(lián)系在了一起。表達(dá)簇的分類分布情況差異表達(dá)的基因GO功能注釋---分成了150RNA-Seq對漿果標(biāo)記基因的驗證用RNA-Seq的數(shù)據(jù)去驗證已報到的十個漿果成熟期的mark基因。事實上從其它方法得到的數(shù)據(jù)去驗證了RNA-Seq數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。RNA-Seq對漿果標(biāo)記基因的驗證用RNA-Seq的數(shù)據(jù)去驗51RNA-Seq結(jié)果與RT-PCR具有高度一致性RT-PCR驗證結(jié)果RNA-Seq結(jié)果與RT-PCR具有高度一致性RT-PCR驗52That’sall,thankyou!That’sall,thankyou!539、春去春又回，新桃換舊符。在那桃花盛開的地方，在這醉人芬芳的季節(jié)，愿你生活像春天一樣陽光，心情像桃花一樣美麗，日子像桃子一樣甜蜜。2023/10/22023/10/2Monday,October2,202310、人的志向通常和他們的能力成正比例。2023/10/22023/10/22023/10/210/2/202311:30:14AM11、夫?qū)W須志也