層析：凝膠層析、裝層析柱的過程及裝柱要求等特制課件

層析

CHROMATOGRAPHY1行業(yè)學(xué)習(xí)層析

CHROMATOGRAPHY1行業(yè)學(xué)習(xí)掌握：層析的概念、一般原理

凝膠層析的基本原理裝層析柱的過程及裝柱要求熟悉：層析技術(shù)的分類凝膠層析的特點(diǎn)凝膠的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)了解：凝膠的選擇柱、樣品、洗脫液的選擇凝膠的保存2行業(yè)學(xué)習(xí)掌握：層析的概念、一般原理2行業(yè)學(xué)習(xí)一.概述

層析Chromatography(色譜),利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)間的差異(溶解度、分子極性、分子大小、分子形狀、吸附能力、分子親合力等)，使各組分在支持物上集中分布在不同區(qū)域，借此將各組分分離。3行業(yè)學(xué)習(xí)一.概述層析Chromatogra色譜歷史古羅馬人分析混合染料（類似輻射紙色譜）1903（1906）年，MichaelTswett提出色譜法1931年，Kuhn采用柱色譜分離了類胡蘿卜素1941年，Martin和Synge提出分配色譜法1944年，Martin等又提出紙色譜法1952年，Martin和James發(fā)明了氣液色譜法1955年，第一臺商品氣相色譜問世，標(biāo)志著現(xiàn)代色譜分析的建立1956年，Stahl系統(tǒng)研究了薄層色譜法(TLC)4行業(yè)學(xué)習(xí)色譜歷史古羅馬人分析混合染料（類似輻射紙色譜）1903（191958年，Stein和Moore研制出氨基酸分析儀，確定了核糖核酸的分子結(jié)構(gòu)1967年，Horvvath和Huber等研制了高效液相色譜(high-performanceliquidchromatography,HPLC)儀1975年，Small等提出離子色譜

20世紀(jì)80年代，超臨界色譜20世紀(jì)90年代，毛細(xì)管電泳（1809年Re?ss第一次電泳實驗）21世紀(jì)，聯(lián)用技術(shù)、大分子色譜分離、制備色譜可望取得更大的發(fā)展5行業(yè)學(xué)習(xí)1958年，Stein和Moore研制出氨基酸分析儀，確定了層析法進(jìn)行時有兩個相，一個相稱為固定相(Stationaryphase)，另一相稱為流動相(Mobilephase)。由于各組分所受固定相的阻力和流動相的推力影響不同，各組分移動速度也各異，從而使各組分得到分離。6行業(yè)學(xué)習(xí)層析法進(jìn)行時有兩個相，一個相稱為固定7行業(yè)學(xué)習(xí)7行業(yè)學(xué)習(xí)二.層析技術(shù)的分類

1.按兩相所處的狀態(tài)分類以液體作為流動相的層析稱為液相層析，以氣體作為流動相的稱為氣相層析。其固定相也可有兩種狀態(tài)，一種是以固體作為吸附劑的固定相，另一種是以涂布在固體載體表面的液體作為固定相。8行業(yè)學(xué)習(xí)二.層析技術(shù)的分類1.按兩相所處的狀態(tài)分類8行業(yè)學(xué)習(xí)層析氣相層析（gas-chromatography）液相層析（liquid-chromatography）氣-固層析（gas-solidchromatography）氣-液層析（gas-liquidchromatography）液-固層析（liquid-solidchromatography）液-液層析（liquid-liquidchromatography）9行業(yè)學(xué)習(xí)層析氣相層析（gas-chromatography）液相層析2.按層析過程的機(jī)制可分為

.吸附層析(adsorptionchromatography)

----利用吸附劑對不同組分吸附能力的不同加以分離的方法。

.分配層析(partitionchromatography)

----利用不同組分在流動相和固定相中的

分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離的方法。10行業(yè)學(xué)習(xí)2.按層析過程的機(jī)制可分為10行業(yè)學(xué)習(xí)

.離子交換層析（ion-exchangechromatography）

----利用離子交換劑與各組分之間的離子親和力不同而進(jìn)行層析分離的方法。

.凝膠層析（gelchromatography）

----利用不同組分之間分子大小不同，在通過凝膠介質(zhì)時所受到的阻滯作用的差異而進(jìn)行分離的方法。

.親和層析（affinitychromatography）----利用生物大分子之間特有親和力的不同進(jìn)分離純化的方法。11行業(yè)學(xué)習(xí).離子交換層析11行業(yè)學(xué)習(xí)3.按操作技術(shù)形式分類

.柱層析（columchromatography）

----將固定相裝在層析柱中，使樣品朝著一個方向移動，通過各組分隨流動相流動而得到分離的方法。12行業(yè)學(xué)習(xí)3.按操作技術(shù)形式分類12行業(yè)學(xué)習(xí)

紙層析（paperchrmatography）

----用紙作為液體的載體，樣品點(diǎn)在紙上隨后展開達(dá)到分離鑒定的方法。

.薄層層析（thinlayperchromatography）

----將適當(dāng)?shù)奈絼┰诓ＡО寤蚱渌牧媳“迳箱伋杀樱瑯悠伏c(diǎn)在上面隨后用流動相展開達(dá)到分離鑒定的方法。13行業(yè)學(xué)習(xí)紙層析（paperchrmatography）13行業(yè)三.層析的一般原理

14行業(yè)學(xué)習(xí)三.層析的一般原理14行業(yè)學(xué)習(xí)1.分配系數(shù)(Partitionchromatography)混合物在層析過程中不管層析技術(shù)采用哪兩種狀態(tài)的相(流動相和固定相)都能達(dá)到分配平衡，用來敘述一種物質(zhì)在兩種特定相中的分配程度是用分配系數(shù)表示的。15行業(yè)學(xué)習(xí)1.分配系數(shù)15行業(yè)學(xué)習(xí)

分配系數(shù)----是一種物質(zhì)在兩種特定相中分配，在特定的溫度時這個系數(shù)的值是一個常數(shù)，即:溶質(zhì)在固定相中的濃度CsK=————————————=——

溶質(zhì)在流動相中的濃度Cm16行業(yè)學(xué)習(xí)分配系數(shù)----是一種物質(zhì)在兩種特定相中分配，在特定的溫度有效分配系數(shù)：定義為化合物在一個相的總量除以另一個相中的總量。實際上是分配系數(shù)乘以兩個相的體積比。在不同的層析機(jī)制中,分配系數(shù)K的含義不同,在吸附層析中,K為吸附平衡常數(shù);在分配層析中,K為分配系數(shù);在離子交換層析中K為交換常數(shù).17行業(yè)學(xué)習(xí)有效分配系數(shù)：定義為化合物在一個相的總量除以另一個相中的總量

分配系數(shù)K值大,說明物質(zhì)在層析中被固定相吸附得比較牢固,隨流動相遷移的速度較慢,留在固定相中的時間較長,在洗脫液中后出峰。若分配系數(shù)K值小，則該物質(zhì)在洗脫液中較早出峰。18行業(yè)學(xué)習(xí)分配系數(shù)K值大,說明物質(zhì)在層析中被固

從一個混合物中分離和純化一種生物物質(zhì)的純度如何，取決于混合物中各組分K值的差異程度?；旌衔镏懈鹘M分若K值相差較大,則能較易地把混合物中的生物物質(zhì)分離。反之,K值相差較小,不易把混合物中的生物物質(zhì)分離。19行業(yè)學(xué)習(xí)從一個混合物中分離和純化一種生物物質(zhì)2.討論層析中的移動情況通常采用平衡過程的研究方法,把層析柱劃分為若干連續(xù)部分,每個體系都達(dá)到平衡。理論板數(shù)(n)：在層析柱上，溶劑連續(xù)不斷加入，化合物在流動相和固定相中不斷分配平衡，所發(fā)生的平衡次數(shù)稱為理論板數(shù)。20行業(yè)學(xué)習(xí)2.討論層析中的移動情況20行業(yè)學(xué)習(xí)

凝膠層析

GelChromatography

21行業(yè)學(xué)習(xí)凝膠層析

GelChromato一、定義

凝膠層析…是按照被分離物質(zhì)分子大小,經(jīng)過具有一定孔徑的多孔物質(zhì)進(jìn)行分離的一種方法。其又稱為凝膠過濾或分子篩過濾或排阻層析。22行業(yè)學(xué)習(xí)一、定義

凝膠層析…是按照被分離物主要機(jī)理是分子篩效應(yīng),當(dāng)被分離物質(zhì)流經(jīng)凝膠柱時,因各組份的分子大小不同,在凝膠受到的阻滯作用有差異,從而造成各組分在凝膠柱中的遷移速度不同得到分離。23行業(yè)學(xué)習(xí)主要機(jī)理是分子篩效應(yīng),當(dāng)被分離物質(zhì)流二.基本原理

流動相（洗脫液）固定相（凝膠）

原理：被分離物質(zhì)中各組分的分子量不同。24行業(yè)學(xué)習(xí)二.基本原理流動相（洗脫液）24行業(yè)學(xué)習(xí)進(jìn)入具有一定孔徑的凝膠柱后,較大的分子不能進(jìn)入凝膠孔隙中,被排阻在外,而較小的分子則能進(jìn)入凝膠孔隙,加入洗脫劑后,大分子就隨洗脫劑從凝膠間隙洗脫下來,受到的阻力小,其流速較快,小分子物質(zhì)從上一層凝膠孔隙中出來又?jǐn)U散到下一層凝膠孔隙中,這樣多次反復(fù),大分子物質(zhì)先從柱中流出,小分子物質(zhì)后流出。25行業(yè)學(xué)習(xí)進(jìn)入具有一定孔徑的凝膠柱后,較大的分26行業(yè)學(xué)習(xí)26行業(yè)學(xué)習(xí)27行業(yè)學(xué)習(xí)27行業(yè)學(xué)習(xí)

小分子由于擴(kuò)散作用進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部而被滯留,大分子被排阻在凝膠顆粒外面,在顆粒之間迅速通過。28行業(yè)學(xué)習(xí)小分子由于擴(kuò)散作用進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部而凝膠層析過程的數(shù)理關(guān)系

柱床體積(VT)……即凝膠體積以及顆粒內(nèi)外間隙體積的總和。VT=1/4

D2hD是內(nèi)壁的直徑h是凝膠層析柱床的高度。29行業(yè)學(xué)習(xí)凝膠層析過程的數(shù)理關(guān)系柱床體積(VT)……即凝膠體積洗脫體積（Ve）…即欲分離物質(zhì)通過層析柱洗脫下來所需洗脫液的總體積。外水體積（V0）…即存在于柱床內(nèi)凝膠外面空隙之間的水相體積，相應(yīng)于一般層析法中流動相的體積。30行業(yè)學(xué)習(xí)洗脫體積（Ve）…即欲分離物質(zhì)通過層析30行業(yè)學(xué)習(xí)內(nèi)水體積（Ｖｉ）…即凝膠顆粒內(nèi)部所含水相的體積，它可從干凝膠顆粒重量和吸水重量求得。凝膠干體積（Ｖｇ）31行業(yè)學(xué)習(xí)內(nèi)水體積（Ｖｉ）…即凝膠顆粒內(nèi)部所含31行業(yè)學(xué)習(xí)ＶＴ＝Ｖ０+Ｖｉ＋Ｖｇ

32行業(yè)學(xué)習(xí)ＶＴ＝Ｖ０+Ｖｉ＋Ｖｇ32行業(yè)學(xué)習(xí)洗脫體積與Ｖｏ及Ｖｉ之間的關(guān)系

Ｖｅ＝Ｖｏ＋ＫｄＶｉＫｄ＝（Ｖｅ－Ｖｏ）／Ｖｉ33行業(yè)學(xué)習(xí)洗脫體積與Ｖｏ及Ｖｉ之間的關(guān)系Ｖｅ＝Ｖｏ＋ＫｄＶｉ33行業(yè)Ｋｄ為樣品組分的分配系數(shù)，也可以說Ｋｄ是分子量不同的溶質(zhì)在凝膠內(nèi)部和外部的分配系數(shù)。它只與被分離物質(zhì)分子的大小和凝膠顆粒孔隙的大小分布有關(guān)，而與柱的長短粗細(xì)無關(guān)，也就是說它對每一物質(zhì)為常數(shù)與柱的物理條件無關(guān)。34行業(yè)學(xué)習(xí)Ｋｄ為樣品組分的分配系數(shù)，也可以說34行業(yè)學(xué)習(xí)Ｋｄ可通過實驗求得。

Ve為實際測得洗脫體積。

Vo可用不被凝膠滯留的大分子物質(zhì)的溶液（最好有顏色以便于觀察如Hb、印度黑墨水）通過實際測量求出.Vi可由g·Wr求得（g為干凝膠重,單位為克,Wr為凝膠的吸水量以ml/g表示）。35行業(yè)學(xué)習(xí)Ｋｄ可通過實驗求得。35行業(yè)學(xué)習(xí)

Ve-VoKd=————Vi（1）Kd=0時,Ve=Vo,意味著該分子完全被排阻于凝膠顆粒之外,全部分布于流動相里,在固定相分布為0,而最先流出。（2）當(dāng)Kd=1時,Ve=Vo+Vi,意味著該分子完全不被排阻,可以自由地擴(kuò)散進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部,它能均等地分布在流動相和固定相里,在兩相分配的比值為1,而最后流出.（3）當(dāng)0<Kd<1,Ve=Vo+ViKd為處于兩種極端行為之間的分子。

36行業(yè)學(xué)習(xí)

（4）Kd>1現(xiàn)象說明凝膠對組分有吸附作用,此時Ve>Vo+Vi,例如一些芳香族化合物的洗脫體積遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出理論計算的最大值,這些化合物的Kd>1如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。37行業(yè)學(xué)習(xí)（4）Kd>1現(xiàn)象說明凝膠對組分有吸附作用,此時Ve>V因此分子的正常Kd值0~1之間,這種由小到大的Kd值順序決定了物質(zhì)流出的順序。38行業(yè)學(xué)習(xí)因此分子的正常Kd值0~1之間,這種由小到大的Kd值順序決定Ve與MW的關(guān)系

對同一類型的化合物,洗脫特性與組分的分子量有關(guān),流過凝膠柱時,按分子量(MW)大小順序流出,MW大的走在前面,Ve與MW的關(guān)系可用下式表示:

Ve=K1-K2lgMWK1K2為常數(shù),MW為分子量39行業(yè)學(xué)習(xí)Ve與MW的關(guān)系對同一類型的化合物三.凝膠層析的特點(diǎn)

40行業(yè)學(xué)習(xí)三.凝膠層析的特點(diǎn)40行業(yè)學(xué)習(xí)（一）優(yōu)點(diǎn)

1.凝膠是一種不帶電荷的惰性載體。其結(jié)

構(gòu)穩(wěn)定,所以凝膠本身不與樣品發(fā)生化

學(xué)反應(yīng)。2.凝膠層析的操作條件較溫和,不易引起生物物質(zhì)的變性,即使用來分離一些理化性質(zhì)不穩(wěn)定的物質(zhì)也很少被破壞。3.樣品得率高,重復(fù)性好.如果按比例擴(kuò)大柱的體積和高度,可進(jìn)行大量樣品的分離純化。41行業(yè)學(xué)習(xí)（一）優(yōu)點(diǎn)

1.凝膠是一種不帶電荷的惰性載體。其結(jié)4（二）缺點(diǎn)1.要求樣品和洗脫液的粘度很低。2.凝膠顆粒網(wǎng)絡(luò)孔徑大小非常有限,所以可被純化的物質(zhì)的分子量范圍受到限制。3.凝膠結(jié)構(gòu)對某些溶質(zhì)分子具有吸附作用,如芳香族化合物與脂蛋白等。

42行業(yè)學(xué)習(xí)（二）缺點(diǎn)1.要求樣品和洗脫液的粘度很低。42行業(yè)學(xué)習(xí)四.凝膠的結(jié)構(gòu)與性能

1.葡聚糖凝膠（商品名為Sephadex）

結(jié)構(gòu)：葡聚糖用交聯(lián)劑1-氯代-2,3-環(huán)丙烷使葡聚糖之間通過醚鍵(C-O-CH2-CH-CH2-O-)交聯(lián)聚合而成的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。OH43行業(yè)學(xué)習(xí)四.凝膠的結(jié)構(gòu)與性能

1.葡聚糖凝膠（商品名為Sephad特點(diǎn)：

Sephadex的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的網(wǎng)孔大小取決于交聯(lián)度,交聯(lián)度的大小可在合成Sephadex時控制加入交聯(lián)劑的百分比決定.交聯(lián)劑的百分比高,交聯(lián)度大,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)愈緊密,孔隙愈小,吸水后膨脹也愈小,機(jī)械強(qiáng)度高,分離物質(zhì)的分子量也小。反之,交聯(lián)劑的百分比低,分離物質(zhì)的分子量大。G類Sephadex的型號表示每克干凝膠吸水量x10,如G-50表示每克干凝膠吸水量為5ml。Sephadex的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,不溶于水、鹽、弱酸和堿,耐熱耐堿不耐酸。44行業(yè)學(xué)習(xí)特點(diǎn)：44行業(yè)學(xué)習(xí)2.瓊脂糖凝膠（商品名為Sepharose)

它是一種大孔凝膠,其工作范圍的下限幾乎是Sephadex的上限,可分離MW40萬以上的物質(zhì),因此可用來分離核酸及病毒。瓊脂糖凝膠不帶電荷,不受微生物作用而降解,但對熱不穩(wěn)定,易受pH影響(只在pH4.5-9.0范圍內(nèi)穩(wěn)定.45行業(yè)學(xué)習(xí)2.瓊脂糖凝膠（商品名為Sepharose)45行業(yè)學(xué)習(xí)3.聚丙烯酰胺凝膠使用范圍及效果同葡聚糖凝膠相似,但化學(xué)性質(zhì)較葡聚糖穩(wěn)定,可在pH2-11范圍內(nèi)使用.聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠－P（Bio-GelP），由美國Bio-Rod廠生產(chǎn)，型號很多，從P-2至P-300共10種，P后面的數(shù)字再乘1000就相當(dāng)于該凝膠的排阻限度。

46行業(yè)學(xué)習(xí)3.聚丙烯酰胺凝膠46行業(yè)學(xué)習(xí)4.凝膠的選擇選擇何種凝膠以及它的型號,這需要根據(jù)實驗條件,溶質(zhì)的分子量的大小和分離工作的目的而定,每種型號凝膠都有一定分離溶質(zhì)分子量的范圍,選擇的型號凝膠要能滿足實驗要求。47行業(yè)學(xué)習(xí)4.凝膠的選擇47行業(yè)學(xué)習(xí)六.其它條件選擇

1.柱的選擇層析的長度（L）與直徑（D）之比（L/D）對層析分辨率有影響,一般對用于組別分離的層析柱其L/D為15～18：1,層析柱的體積一般大于樣品體積的4～10倍,這類常用于脫鹽.對于分級分離可采用L/D40：1,甚至100：1,層析柱體積一般大于樣品體積的25倍。柱短而粗,則易使樣品稀釋,柱長而窄,則柱的管壁效應(yīng)較大,會造成拖尾現(xiàn)象。48行業(yè)學(xué)習(xí)六.其它條件選擇

1.柱的選擇48行業(yè)學(xué)習(xí)2.樣品的選擇：

量適當(dāng),粘度小。3.洗脫液的選擇：每種樣品分離所用的緩沖洗脫液應(yīng)根據(jù)使樣品穩(wěn)定的原則使用。49行業(yè)學(xué)習(xí)2.樣品的選擇：49行業(yè)學(xué)習(xí)七.應(yīng)用

1.分離純化2.脫鹽3.高分子溶液的濃縮4.測分子量50行業(yè)學(xué)習(xí)七.應(yīng)用

1.分離純化50行業(yè)學(xué)習(xí)凝膠層析法分離蛋白質(zhì)

51行業(yè)學(xué)習(xí)凝膠層析法分離蛋白質(zhì)51行業(yè)學(xué)習(xí)[原理]血紅蛋白（Hb，分子量64480左右）與二硝基苯—魚精蛋白（DNP—魚精蛋白，分子量2000—12000）混合物，由于分子大小不同，通過SephadexG—50層析受阻滯程度有差異，從而達(dá)到分離。52行業(yè)學(xué)習(xí)[原理]血紅蛋白（Hb，分子量64480左右）與二硝基[器材]層析柱（1.5×25ml）等[試劑]1.樣品液：DNP-魚精蛋白、Hb2.SephadexG-5053行業(yè)學(xué)習(xí)[器材]53行業(yè)學(xué)習(xí)[操作]1.裝柱：在層析柱的底部出口套上乳膠塑料管，向?qū)游鲋鶅?nèi)加蒸餾水趕走在層析柱的死體積和接口處的氣泡，在蒸餾水高度約占體積的1/3時，關(guān)閉下端出口，自頂部緩緩加入已處理好的SephadexG-50懸液，待底部凝膠沉積1~2cm時，再打開出口，凝膠加至凝膠沉積離層析柱口約3cm即可。

54行業(yè)學(xué)習(xí)[操作]1.裝柱：在層析柱的底部出口套上乳膠塑料管，向?qū)游鲅b柱注意點(diǎn)：不得有氣泡和分層；凝膠表面應(yīng)平整；柱床體積穩(wěn)定；不能讓凝膠表面露出水面。55行業(yè)學(xué)習(xí)裝柱注意點(diǎn)：55行業(yè)學(xué)習(xí)2.加樣：取樣品液5滴即為上柱樣品。將出口打開，使表面的蒸餾水流出，直至恰好與表面相平（不可使床面干掉），關(guān)緊出口，用滴管將上述樣品緩緩地加到床表面，注意盡量不要使平整的床表面攪動，然后打開出口，讓樣品進(jìn)入床內(nèi)，直至床面恰好露出，用上法不斷加蒸餾水洗滌，立即用試管收集，待紅色流盡，換試管收集。56行業(yè)學(xué)習(xí)2.加樣：取樣品液5滴即為上柱樣品。將出口打開，使表面的蒸3.觀察實驗現(xiàn)象，并計算Hb的洗脫體積（Ve）和DNP-魚精蛋白的Ve。4.再生用蒸餾水洗滌凝膠層析柱10分鐘，此柱即可再生。57行業(yè)學(xué)習(xí)3.觀察實驗現(xiàn)象，并計算Hb的洗脫體積（Ve）和DNP-魚把菊根粉或白堊粉（CaCO3）裝在玻璃管中，將植物葉子的石油醚提取液倒入管中，然后加入石油醚淋洗。隨著淋洗進(jìn)行，樣品中各種色素向下移動的速度不同，逐漸形成一圈圈的連續(xù)色帶。茨維特在當(dāng)時的實驗中觀察到6個色帶，它們分別是胡蘿卜素、葉黃素和葉綠素A和B。提取液色帶ChromatographiccolumnStationaryphaseMobilephaseoreluent

58行業(yè)學(xué)習(xí)把菊根粉或白堊粉（CaCO3）裝在玻璃管中，將植物葉子的石油Themobile(top)andstationary(bottom)phasesincolumnchromatography.

59行業(yè)學(xué)習(xí)Themobile(top)andstationarPaperchromatographyisananalyticalmethod.Notetheverysmallsamplevolumespottedontotheplate.60行業(yè)學(xué)習(xí)Paperchromatographyisanana姜黃素浸膏薄層色譜實驗一、展開劑：按二氯甲烷：甲醇=9：1配制展開劑倒入層析缸中約10-20ml

二、點(diǎn)樣：用易揮發(fā)溶劑乙醇