第2節(jié)基因工程的基本操作程序

第2節(jié)基因工程的基本操作程序?qū)W有目標——課標要求必明1．闡述基因工程的原理和基本操作程序。2．針對人類生產(chǎn)或生活中的某一需求，選取適當?shù)幕蚬こ痰募夹g(shù)和方法，嘗試設計獲得某一轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的方案。3.嘗試進行PCR的基本操作，并用電泳鑒定PCR的產(chǎn)物。記在平時——核心語句必背1．基因工程的基本操作程序：目的基因的篩選與獲取→基因表達載體的構(gòu)建→將目的基因?qū)胧荏w細胞→目的基因的檢測與鑒定。2．PCR反應中需要提供DNA模板、分別與兩條模板鏈結(jié)合的2種引物、4種脫氧核苷酸和耐高溫的DNA聚合酶。PCR反應中每次循環(huán)一般可分為變性、復性、延伸三步。3．基因表達載體的構(gòu)建是基因工程的核心，基因表達載體是載體的一種，除了目的基因外，它還必須有啟動子、終止子以及標記基因等。4．將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ㄓ修r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和花粉管通道法。導入動物細胞常用顯微注射技術(shù)，導入微生物細胞常用感受態(tài)細胞法(Ca2＋處理法)。續(xù)表[主干知識梳理]一、目的基因的篩選與獲取1．目的基因(1)概念：用于改變

或獲得

等的基因。(2)實例：培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉用到的目的基因是

。2．篩選合適的目的基因(1)較為有效的方法：從相關(guān)的

和

的基因中進行篩選。(2)實例：在培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉之前，科學家不僅掌握了Bt基因的

，也對Bt基因的表達產(chǎn)物——

有了較為深入的了解。(3)認識基因結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)方法：___________技術(shù)、

數(shù)據(jù)庫、__________工具。受體細胞性狀預期表達產(chǎn)物Bt抗蟲蛋白基因已知結(jié)構(gòu)功能清晰序列信息Bt抗蟲蛋白DNA測序遺傳序列序列比對3．利用PCR獲取和擴增目的基因(1)PCR的含義：PCR是________________的縮寫，它是一項根據(jù)________________的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對_________的核苷酸序列進行大量復制的技術(shù)。(2)條件：DNA模板、分別與兩條模板鏈結(jié)合的2種

、4種

、耐高溫的

。(3)過程①變性：當溫度超過90℃時，目的基因DNA

。②復性：當溫度下降到50℃左右時，

通過堿基互補配對與兩條單鏈DNA結(jié)合。聚合酶鏈式反應DNA半保留復制目的基因引物脫氧核苷酸DNA聚合酶受熱變性后解為單鏈兩種引物③延伸：當溫度上升到72℃左右時，溶液中_______________在耐高溫的____________的作用下加到引物的

端合成子鏈。④重復循環(huán)多次。(4)結(jié)果：每次循環(huán)后目的基因的量增加一倍，即成

形式擴增(約為2n，其中n為擴增循環(huán)的次數(shù))。二、基因表達載體的構(gòu)建1．構(gòu)建基因表達載體的目的(1)使目的基因在受體細胞中

，并且可以

給下一代。(2)使目的基因能夠

和發(fā)揮作用。4種脫氧核苷酸DNA聚合酶3′指數(shù)穩(wěn)定存在遺傳表達2．基因表達載體的組成(填圖)。3．基因表達載體的構(gòu)建首先用一定的

切割載體，使它出現(xiàn)一個切口，然后用

限制酶或_________________的限制酶切割含有目的基因的DNA片段，再利用___________將目的基因片段拼接到載體的切口處。限制酶同種能產(chǎn)生相同末端DNA連接酶三、將目的基因?qū)胧荏w細胞1．轉(zhuǎn)化：目的基因進入受體細胞內(nèi)，并在受體細胞內(nèi)

和

的過程。2．目的基因?qū)胧荏w細胞的方法(1)目的基因?qū)胫参锛毎倩ǚ酃芡ǖ婪?。a．用微量注射器將含目的基因的DNA溶液直接注入

中。b．在植物受粉后的一定時間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助

進入

。維持穩(wěn)定表達子房花粉管通道胚囊②農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。a．農(nóng)桿菌的特點：農(nóng)桿菌自然條件下侵染

植物和

植物；農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒上的

能夠整合到所侵染細胞的

上。b．轉(zhuǎn)化方法：將目的基因插入農(nóng)桿菌

中，讓農(nóng)桿菌侵染植物細胞。(2)目的基因?qū)雱游锛毎俪Ｓ梅椒ǎ?/p>

法。②常用受體細胞：

。(3)目的基因?qū)胛⑸锛毎俜椒ǎ河?/p>

處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，然后將重組的基因表達載體導入其中。②常用受體細胞：原核細胞(使用最廣泛的是大腸桿菌)。雙子葉裸子T--DNA染色體DNATi質(zhì)粒的TDNA顯微注射受精卵Ca2＋四、目的基因的檢測與鑒定1．分子水平檢測(1)通過

等技術(shù)檢測受體細胞染色體DNA上是否插入了目的基因或檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA。(2)從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應的抗體進行

雜交，檢測目的基因是否翻譯成了蛋白質(zhì)。2．個體水平鑒定包括

實驗，以確定是否有抗性及抗性程度?；蚬こ坍a(chǎn)品需要與

進行比較等。PCR抗原－抗體抗蟲、抗病的接種天然產(chǎn)品活性[邊角知識發(fā)掘]1．(教材第80頁圖3-6變式訓練)觀察基因表達載體構(gòu)建模式圖，寫出結(jié)構(gòu)①和②的名稱：①

，②

；物質(zhì)A和B的名稱：A.

，B.

。啟動子終止子限制酶DNA連接酶2．(教材第81頁圖示變式訓練)下圖為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖，請將①～④的操作序號填寫在圖中相應的方框內(nèi)。①轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌②構(gòu)建表達載體③導入植物細胞④將目的基因插入染色體DNA中答案：A.②

B．④

C．①

D．③[教材問題提示]旁欄思考題1．(教材第79頁)mRNA不可以用PCR技術(shù)直接擴增，需要將它逆轉(zhuǎn)錄成cDNA再進行擴增。由mRNA逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA的過程：第一步，逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA鏈，形成RNADNA雜交分子；第二步，核酸酶H降解RNADNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；第三步，以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子(見下圖)。2．(教材第80頁)采用總DNA注射法進行遺傳轉(zhuǎn)化，即將一個生物的總DNA提取出來，沒有進行基因表達載體的構(gòu)建，通過注射或花粉管通道法導入受體植物，這種方法針對性差，完全靠運氣，也無法確定哪些基因?qū)肓耸荏w植物。2．PCR擴增目的基因時，復性溫度的設定是成敗的關(guān)鍵。復性溫度過高會破壞引物與模板的堿基配對，復性溫度過低又會造成引物不能與DNA模板鏈的特定部位結(jié)合。復性溫度的設定與引物長度、堿基組成有關(guān)，假設引物的長度相同，在GC含量高時，對復性溫度的設定有什么要求？說明理由。提示：在引物的GC含量高時，設定的復性溫度要高一些。因為DNA分子中G—C之間有三個氫鍵，A—T之間有兩個氫鍵。3．在利用PCR獲取和擴增目的基因時，從第幾輪循環(huán)才會產(chǎn)生完整的目的基因(可用相關(guān)圖解解釋)?提示：第3輪，如圖所示：[師說重難]

一、利用PCR獲取和擴增目的基因1．PCR反應的過程2．PCR技術(shù)與生物體內(nèi)DNA復制的比較比較項目PCR技術(shù)DNA復制區(qū)別解旋方式DNA在高溫作用下變性解旋解旋酶催化場所細胞外(在PCR擴增儀內(nèi))細胞內(nèi)(主要在細胞核內(nèi))酶耐高溫的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)DNA解旋酶、普通的DNA聚合酶等溫度條件需控制溫度，在較高溫度下進行細胞內(nèi)溫和條件合成的對象DNA片段或基因DNA分子聯(lián)系①模板：均需要脫氧核苷酸鏈作為模板進行物質(zhì)合成②原料：均為四種脫氧核苷酸③酶：均需要DNA聚合酶進行催化④引物：均需要引物，使DNA聚合酶從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸續(xù)表二、基因表達載體的構(gòu)建過程1．用同一種限制酶或產(chǎn)生相同末端的限制酶切割含目的基因的DNA和質(zhì)粒，使其產(chǎn)生相同末端。2．將切下的目的基因片段與切開的質(zhì)粒混合，再加入適量DNA連接酶，使目的基因插入質(zhì)粒的切口處，形成一個重組DNA分子(重組質(zhì)粒)。構(gòu)建過程如下圖所示：[在應用中悟][典例1]下列關(guān)于PCR反應體系中所加物質(zhì)作用的敘述，錯誤的是 (

)A．耐高溫的DNA聚合酶用于催化DNA子鏈的合成B．引物使Taq酶能從引物的5′端延伸DNA鏈C．目標DNA母鏈用作合成DNA復制的模板D．四種脫氧核苷酸為PCR提供能量和原料[解析]

通過PCR技術(shù)擴增目的基因時，需要用耐高溫的DNA聚合酶催化單個脫氧核苷酸聚合形成DNA子鏈，A正確；在復制時，引物與DNA母鏈通過堿基互補配對結(jié)合后，DNA聚合酶從引物的3′端開始延伸DNA鏈，因此DNA合成方向總是從子鏈的5′端向3′端延伸，B錯誤；PCR技術(shù)的原理是DNA雙鏈復制，DNA復制時兩條鏈均作為復制的模板，C正確；DNA合成的原料是四種脫氧核苷酸，同時兩個核苷酸連接時可釋放能量，D正確。[答案]

B[典例2]下列有關(guān)基因表達載體的構(gòu)建的說法，錯誤的是 (

)①一個基因表達載體的組成只包括目的基因、啟動子、終止子②有了啟動子才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA③終止子的作用是使轉(zhuǎn)錄在所需要的地方停止④所有基因表達載體的構(gòu)建是完全相同的⑤必須在細胞內(nèi)進行A．②③⑤

B．①④⑤C．①②⑤ D．③④[解析]基因表達載體的構(gòu)建是基因工程的核心內(nèi)容，基因表達載體是載體的一種，除了目的基因外，它還必須有啟動子、終止子和標記基因等，①錯誤；啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，②正確；終止子控制著轉(zhuǎn)錄的結(jié)束，③正確；由于受體細胞有植物、動物以及微生物之分，以及目的基因?qū)胧荏w細胞的方法不同，因此基因表達載體的構(gòu)建是不完全相同的，④錯誤；基因表達載體的構(gòu)建必須在細胞外進行，⑤錯誤。[答案]

B[在訓練中評]1．下列有關(guān)PCR技術(shù)的敘述，錯誤的是 (

)A．在基因工程中，可通過該技術(shù)獲取目的基因B．要擴增的目的基因的特異性取決于引物序列C．PCR反應過程中需要解旋酶催化D．DNA體外擴增的基本原理與體內(nèi)DNA復制相同解析：在基因工程中，可通過PCR技術(shù)獲取目的基因，A正確；要擴增的目的基因的特異性取決于引物序列，B正確；PCR反應過程中通過高溫解旋不需要解旋酶催化，C錯誤；DNA體外擴增的基本原理與體內(nèi)DNA復制相同，D正確。答案：C

2．基因工程的核心是構(gòu)建基因表達載體，下列不屬于載體作用的是 (

)A．載體能防止目的基因被受體細胞限制酶“切割”B．載體能協(xié)助目的基因在受體細胞中復制C．載體含有啟動子和終止子協(xié)助目的基因表達D．載體具有標記基因，便于篩選含目的基因的受體細胞解析：載體不能防止目的基因被受體細胞限制酶“切割”，A錯誤；載體在受體細胞中能夠穩(wěn)定存在，并且具有自我復制能力，使目的基因數(shù)量擴大，B正確；啟動子是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，能啟動轉(zhuǎn)錄過程；終止子控制著轉(zhuǎn)錄的結(jié)束，所以載體含有的啟動子和終止子可協(xié)助目的基因表達，C正確；載體具有標記基因，標記基因便于篩選含有目的基因的受體細胞，D正確。答案：A

[師說重難]

1．目的基因?qū)胧荏w細胞的方法類型方法說明特點植物細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因插入農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒的TDNA上→轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌→用農(nóng)桿菌侵染植物細胞→將目的基因整合到植物細胞染色體的DNA上→目的基因表達經(jīng)濟、有效，適用于雙子葉植物和裸子植物，尤其適用于雙子葉植物花粉管通道法在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭→滴加DNA(含目的基因)，使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞→目的基因表達簡便、經(jīng)濟，我國科學家獨創(chuàng)的一種方法動物細胞顯微注射技術(shù)將含有目的基因的表達載體提純→取卵(受精卵)→顯微注射→注射了目的基因的受精卵，經(jīng)胚胎早期培養(yǎng)后，移植到雌性動物的輸卵管或子宮內(nèi)→獲得具有新性狀的動物將目的基因?qū)雱游锛毎顬橛行У姆椒ㄎ⑸锛毎鸆a2＋處理法(感受態(tài)細胞法)用Ca2＋處理微生物細胞→感受態(tài)細胞→將基因表達載體與感受態(tài)細胞混合→在一定溫度下促進感受態(tài)細胞吸收DNA分子簡便、經(jīng)濟、有效續(xù)表2．農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法分析(1)構(gòu)建攜帶目的基因的表達載體，需要兩種工具酶：限制酶和DNA連接酶。(2)基因表達載體(重組質(zhì)粒)導入農(nóng)桿菌細胞時，要用Ca2＋處理農(nóng)桿菌細胞，使其處于感受態(tài)，利于重組質(zhì)粒的導入。(3)由導入目的基因的受體細胞培育成完整的植株要用到植物組織培養(yǎng)技術(shù)。3．目的基因的檢測與鑒定的方法比較類型檢測內(nèi)容方法結(jié)果顯示分子水平檢測目的基因是否插入轉(zhuǎn)基因生物DNA上DNA分子雜交技術(shù)(DNA和DNA之間)是否成功顯示出雜交帶目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA分子雜交技術(shù)(DNA和mRNA之間)目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗原－抗體雜交(蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)之間)個體生物學水平鑒定是否具有抗性及抗性程度對轉(zhuǎn)基因生物進行抗性的接種實驗是否賦予了預期抗性或蛋白質(zhì)活性基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能活性是否相同比較基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的功能活性[特別提醒]

①探針是用放射性同位素等標記的含目的基因的DNA片段。②DNA分子雜交和分子雜交(DNA和mRNA之間)的依據(jù)均是堿基互補配對原則。[在應用中悟][典例1]下列關(guān)于目的基因?qū)胧荏w細胞的敘述，錯誤的是 (

)A．培育“黃金大米”可用花粉管通道法導入目的基因B．顯微注射技術(shù)是將目的基因?qū)雱游锛毎捎米疃嗟姆椒–．目的基因?qū)氪竽c桿菌最常用的方法是Ca2＋處理法D．農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法是將目的基因?qū)胫参锛毎畛Ｓ玫姆椒╗解析]水稻的花很小，不適合用花粉管通道法導入目的基因，A錯誤；將目的基因?qū)雱游锛毎Ｓ蔑@微注射法，B正確；將目的基因?qū)胛⑸锛毎畛Ｓ玫姆椒ㄊ怯肅a2＋處理大腸桿菌，使其處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的狀態(tài)，C正確；將目的基因?qū)胫参锛毎畛Ｓ玫姆椒ㄊ寝r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，此外還有基因槍法和花粉管通道法，D正確。[答案]

A[典例2]農(nóng)桿菌侵染植物細胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA插入植物基因組中。圖示為利用農(nóng)桿菌培育轉(zhuǎn)基因植物的基本流程，請據(jù)圖回答：(1)剪除Ti質(zhì)粒的某些片段、替換復制原點O與添加抗生素的抗性基因T的過程①中，需用多種限制酶處理，原因是______________________________________，需用__________________“縫合”雙鏈DNA片段的平末端。(2)目的基因是指__________________。由過程②形成的基因表達載體中，目的基因的上游具有________，它是________________________識別和結(jié)合的部位。(3)過程③常用________處理使農(nóng)桿菌成為感受態(tài)細胞。抗生素抗性基因T的作用是__________________________________________________________________。(4)可通過________技術(shù)檢測試管苗的染色體DNA上是否插入了目的基因。[解析]

(1)Ti質(zhì)粒具多種限制酶切割位點，是因為不同的限制酶識別并切割不同的堿基序列。連接平末端應選用T4DNA連接酶。(2)目的基因主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。目的基因的上游具有啟動子，以便于RNA聚合酶識別和結(jié)合。(3)過程③常采用Ca2＋(CaCl2溶液)處理農(nóng)桿菌，以增大農(nóng)桿菌細胞壁的通透性?？股乜剐曰騎用于檢測受體細胞中是否含有基因表達載體。(4)檢測試管苗的染色體DNA中是否插入目的基因常采用PCR技術(shù)。[答案]

(1)不同的限制酶識別并切割不同的堿基序列T4DNA連接酶(2)編碼蛋白質(zhì)的基因啟動子RNA聚合酶(3)Ca2＋(CaCl2溶液)用于鑒定和篩選導入了基因表達載體的農(nóng)桿菌(4)PCR[在訓練中評]1．農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒上的T-DNA可以轉(zhuǎn)移并隨機插入到被侵染植物的染色體DNA中。研究者將下圖中被侵染植物的DNA片段連接成環(huán)，并以此環(huán)為模板進行PCR，擴增出T-DNA插入位置兩側(cè)的未知序列，據(jù)此可確定T-DNA插入的具體位置。下列有關(guān)說法，正確的是 (

)A．農(nóng)桿菌在自然條件下對大多數(shù)單子葉植物有感染能力B．利用圖中的引物②、③組合可擴增出兩側(cè)的未知序列C．進行PCR擴增時需要有解旋酶和耐高溫的DNA聚合酶D．與受體細胞基因組序列比對可確定T-DNA的插入位置解析：農(nóng)桿菌在自然條件下對大多數(shù)雙子葉植物和裸子植物有感染能力，A錯誤；DNA的兩條鏈反向平行，子鏈從引物的3′端開始延伸，則利用圖中的引物①、④組合可擴增出兩側(cè)的未知序列，B錯誤；進行PCR擴增需要耐高溫的DNA聚合酶(Taq酶)，但不需要解旋酶，C錯誤；通過與受體細胞的基因組序列比對，即可確定T-DNA的插入位置，D正確。答案：D

2．如圖為轉(zhuǎn)基因抗蟲煙草的培育流程，下列敘述正確的是 (

)A．培育過程①需要使用纖維素酶和果膠酶B．培育過程②將重組Ti質(zhì)粒導入煙草細胞前需要使用CaCO3處理農(nóng)桿菌C．培育過程③④僅通過調(diào)節(jié)生長調(diào)節(jié)劑可誘導愈傷組織再生出新植株D．可通過觀察害蟲吞食轉(zhuǎn)基因煙草后的存活情況進行個體水平檢測解析：過程①表示基因表達載體的構(gòu)建過程，即形成重組Ti質(zhì)粒的過程，需要使用限制酶和DNA連接酶，不需要纖維素酶和果膠酶，A錯誤；過程②是將目的基因?qū)胧荏w細胞的過程，在將重組Ti質(zhì)粒導入煙草細胞前需要先使用CaCl2處理農(nóng)桿菌，B錯誤；過程③④為再分化形成植株的過程，該過程中需要通過調(diào)節(jié)營養(yǎng)物質(zhì)和生長調(diào)節(jié)劑的配比，從而實現(xiàn)由愈傷組織誘導出芽和根的頂端分生組織的目的，并由此再生出新植株，C錯誤；可通過進行個體水平的檢測判斷轉(zhuǎn)基因抗蟲煙草是否培育成功，即讓害蟲吞食轉(zhuǎn)基因煙草，觀察害蟲的存活情況進行判斷，D正確。答案：D

2．PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行嚴格滅菌，為什么？提示：避免污染使外源性DNA大量擴增，造成假陽性反應。3．將裝有反應液的微量離心管放入PCR儀中進行反應，程序應該怎樣設定？提示：4．本實驗中DNA遷移速率主要與哪種因素有關(guān)？提示：在本實驗中，主要考慮DNA分子的遷移速率與其大小成反比。5．判斷是否成功擴增出DNA片段的依據(jù)是什么？如果沒有成功應該從哪些方面分析？提示：一次成功的DNA片段擴增應該產(chǎn)生與預期大小一致的DNA片段。若出現(xiàn)與預期不一致的結(jié)果，可嘗試從以下幾個方面進行分析：模板DNA的制備、引物的質(zhì)量與特異性、酶的質(zhì)量以及PCR循環(huán)的條件。6．如果沒有出現(xiàn)擴增條帶，可能的原因有哪些？提示：模板DNA含有蛋白或含有TaqDNA聚合酶的抑制劑(如蛋白酶K、苯酚、EDTA);TaqDNA聚合酶失活；引物出現(xiàn)質(zhì)量問題，濃度不合適；Mg2＋濃度過低；變性溫度低，變性時間短；目的序列變異等。[師說重難]

一、實驗原理1．利用PCR可以在體外進行DNA片段的擴增。PCR利用了DNA的熱變性原理，通過調(diào)節(jié)溫度來控制DNA雙鏈的解聚與結(jié)合。PCR儀實質(zhì)上就是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器。一次PCR一般要經(jīng)歷30次循環(huán)。2．PCR的產(chǎn)物一般通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定。在凝膠中DNA分子的遷移速率與凝膠的濃度、DNA分子的大小和構(gòu)象等有關(guān)。凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300nm的紫外燈下被檢測出來。二、實驗操作步驟1．PCR擴增DNA片段2．電泳法鑒定DNA片段三、實驗注意事項1．微量移液器不能超量程使用。使用一次性屏蔽式吸液槍頭有助于防止吸取的液體流入微量移液器，從而減少實驗過程中的交叉污染。2．為避免外源DNA等因素的污染，PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭和蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌處理。3．為保證加入反應體系中的各試劑體積的準確性，要按照加入體積的大小，由大到小依次加入各試劑，即最先加入無菌水。為保護酶的活性，一般最后加入TaqDNA聚合酶。4．應按照教材或試劑盒說明書建議的體積加入各試劑，隨意加大試劑用量并不會提高PCR擴增的成功率。例如，高濃度的引物可能引發(fā)錯配，導致非特異性擴增；高濃度的4種脫氧核苷酸可能對擴增起抑制作用。5．該實驗所需材料可以直接從公司購買，緩沖液和酶應分裝成小份，并在－20℃儲存。使用前，將所需試劑從冰箱拿出，放在冰塊上緩慢融化。6．在向微量離心管中添加反應組分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換。7．在進行操作時，一定要戴好一次性手套。8．配膠時，當凝膠溶液冷卻到不燙手時可加入核酸染料，科學研究中最常用的是EB(溴化乙錠)。EB是一種熒光染料，有劇毒，具有高致癌性，可用其他靈敏度高、毒性低的新型核酸染料替代它，如Goldview。[在應用中悟][典例1]下列關(guān)于PCR操作過程的敘述，錯誤的是 (

)A．PCR實驗中使用的微量離心管、槍頭、緩沖液以及蒸餾水等在使用前必須進行高壓滅菌B．PCR所用的緩沖液和酶應分裝成小份，并在－20℃儲存C．PCR所用的緩沖液和酶從冰箱拿出之后，迅速融化D．在微量離心管中添加反應成分時，每吸取一種試劑后，移液器上的槍頭都必須更換[解析]在冰箱中放置的緩沖液和酶，取出后應放在冰塊上緩慢融化，不能迅速融化。[答案]

C[典例2]

(2021·全國甲卷)PCR技術(shù)可用于臨床的病原菌檢測。為檢測病人是否感染了某種病原菌，醫(yī)生進行了相關(guān)操作：①分析PCR擴增結(jié)果；②從病人組織樣本中提取DNA；③利用PCR擴增DNA片段；④采集病人組織樣本。回答下列問題：(1)若要得到正確的檢測結(jié)果，正確的操作順序應該是__________(用數(shù)字序號表示)。(2)操作③中使用的酶是__________。PCR反應中的每次循環(huán)可分為變性、復性、__________三步，其中復性的結(jié)果是_________________________________。(3)為了做出正確的診斷，PCR反應所用的引物應該能___________特異性結(jié)合。(4)PCR(多聚酶鏈式反應)技術(shù)是指____________________________________。該技術(shù)目前被廣泛地應用于疾病診斷等方面。[解析]

(1)PCR技術(shù)可用于臨床的病原菌檢測，若要得到正確的檢測結(jié)果，正確的操作順序應該是④采集病人組織樣本→②從病人組織樣本中提取DNA→③利用PCR擴增DNA片段→①分析PCR擴增結(jié)果。(2)在用PCR技術(shù)擴增DNA時，DNA的復制過程與細胞內(nèi)DNA的復制類似，操作③中使用的酶是Taq酶(熱穩(wěn)定DNA聚合酶)，PCR反應中的每次循環(huán)可分為變性、復性、延伸三步，其中復性的結(jié)果是Taq酶從引物起始進行互補鏈的合成。(3)DNA復制需要引物，為了做出正確的診斷，PCR反應所用的引物應該能與兩條單鏈DNA特異性結(jié)合。(4)PCR(多聚酶鏈式反應)技術(shù)是一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。該技術(shù)目前被廣泛地應用于疾病診斷等方面。[答案]

(1)④②③①

(2)Taq酶(熱穩(wěn)定DNA聚合酶)延伸Taq酶從引物起始進行互補鏈的合成(3)兩條單鏈DNA

(4)一項在生物體外復制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)[在訓練中評]1．PCR(多聚酶鏈式反應)是一項在生物體外復制特定的DNA片段的核酸合成技術(shù)，下圖表示合成過程。下列說法錯誤的是 (

)A．a(chǎn)過程高溫使DNA變性解旋，該過程不需要解旋酶的作用B．c過程要用到的酶在高溫下失活，因此在PCR擴增時需要再添加C．如果把模板DNA的兩條鏈用15N標記，游離的脫氧核苷酸不標記，控制“94℃～55℃～72℃”溫度循環(huán)3次，則在形成的子代DNA中含有15N標記的DNA占25%D．PCR中由堿基錯配引起的變異屬于基因突變解析：PCR中解旋是通過高溫進行的，該過程不需要解旋酶的作用，A正確；c過程用到的酶為耐高溫的DNA聚合酶，在高溫下不會失活，因此在PCR擴增時不需要再添加，B錯誤；如果把模板DNA的兩條鏈用15N標記，游離的脫氧核苷酸不做標記，循環(huán)3次后，形成的DNA分子為8個，而含有15N標記的DNA分子為2個，故在形成的子代DNA中含有15N標記的DNA占25%，C正確；PCR中由堿基錯配引起的變異屬于基因突變，D正確。答案：B

2．下列有關(guān)電泳的敘述，錯誤的是 (

)A．電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程B．待測樣品中各種分子的形狀、大小及帶電性質(zhì)的差異等會影響其在電泳中的遷移速度C．進行電泳時，帶電粒子會向著與其所帶電荷相同的電極移動D．常用的電泳方法是瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳解析：電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程，A正確；待測樣品中各種分子的形狀、大小及帶電性質(zhì)的差異等會影響其在電泳中的遷移速度，B正確；進行電泳時，帶電粒子會向著與其所帶電荷相反的電極移動，C錯誤；常用的電泳方法是瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳，D正確。答案：C

科學思維——歸納比較目的基因的檢測與鑒定方法1．目的基因檢測與鑒定方法的比較續(xù)表場所不論是復制水平、轉(zhuǎn)錄水平還是翻譯水平上的檢測，都是在體外進行的原理進行轉(zhuǎn)錄水平的檢測原理與復制水平的檢測原理是相似的，都遵循堿基互補配對原則，只是被檢測的物質(zhì)不再是轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA，而是轉(zhuǎn)基因生物細胞內(nèi)的mRNA；進行翻譯水平的檢測，則是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理