免疫組織化學與熒光原位雜交方法檢測乳腺癌中c-erbb-2蛋白表達和her2基因擴增的對比研究

免疫組織化學與熒光原位雜交方法檢測乳腺癌中c-erbb-2蛋白表達和her2基因擴增的對比研究

原生代因ha2的蛋白表達產(chǎn)物是一種跨膜糖蛋白（p185），具有酪氨酸激酶活性。這是表皮生長因子受體的成員。它通過細胞之間的信號傳達來調(diào)節(jié)細胞的生長、分化和生長。目前研究表明,在乳腺癌中約有25%-30%的病例有HER2基因的擴增和蛋白的過度表達,HER2陽性乳腺癌患者的復發(fā)及轉(zhuǎn)移率高、預后不良,且常規(guī)化療效果不佳,而針對HER2陽性的分子靶向抗體赫賽汀(Herceptin)對乳腺癌有很好的療效,因此HER2的檢測廣泛受到臨床和病理醫(yī)師的重視。目前常用的檢測方法有IHC和FISH,但由于IHC檢測C-cerB-2陽性也并非代表的HER2基因擴增,我們應用IHC和FISH檢測乳腺癌中的C-erbB-2蛋白及HER2基因表達狀況,分析二者之間一致性及實際應用價值,為乳腺癌的診斷與治療提供可靠依據(jù)。材料和方法1.手術(shù)切除標本58例乳腺癌為本院病理科2008年1月-2008年9月的活檢和手術(shù)切除標本,其中浸潤性導管癌54例,浸潤性小葉癌4例;所有病例均未行術(shù)前新輔助化療。2.方法2.1常規(guī)切片觀測標本離體后立即固定于10%的中性福爾馬林中,固定時間8-24h,常規(guī)脫水包埋,以4μm厚度連續(xù)切片3張分別用于HE染色、IHC和FISH檢測。2.2微波抗體檢測C-erbB-2一抗為即用型單克隆抗體(LabVision產(chǎn)品),MaxVisionTM快速法試劑盒購自邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。常規(guī)切片、脫蠟入純水。組織切片放入pH6.0的檸檬酸緩沖液中,微波抗原修復,用PBS(pH7.4)洗片后入3%甲醇H2O210min,充分洗滌后加入一抗4℃冰箱過夜,PBS充分洗片,切片滴加即用型MaxVisionTM試劑,室溫孵育15min,洗滌后加DAB顯色液后顯微鏡下觀察信號并終止顯色,蘇木素襯染,脫水、透明、封固。已知陽性切片作陽性對照,PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。2.3玻片的制備GLPHER2/CSP17探針試劑盒(購自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司)。組織切片室溫下脫蠟,水化,酸性亞硫酸鈉50℃處理,蛋白酶K37℃消化,HCl浸泡,-20℃梯度乙醇中脫水,室溫浸入丙酮固定,自然干燥玻片。55℃加熱玻片5-10min,變性液中浸泡5min,梯度脫水,將10μl變性后的探針混合物滴于玻片雜交區(qū)域。封片后置于預熱的濕盒中,42℃保溫箱中過夜雜交16h。移去蓋玻片,立即將玻片分別置于50%甲酰胺/2×SSC、2×SSC0.1%NP-40/2×SSC溶液中漂洗,70%乙醇浸泡3min后取出玻片,暗處自然干燥,將15μlDAPI復染劑滴加于雜交區(qū)域位置,覆以蓋玻片。暗處放置20min后在熒光顯微鏡下觀察雜交信號。2.4對結(jié)果的評估如下(1)瘤細胞染色體參照美國臨床腫瘤協(xié)會/美國病理學家學院HER2檢測指南評分系統(tǒng):浸潤性腫瘤細胞無著色為陰性(0),瘤細胞呈弱且不完整的胞膜著色或<10%瘤細胞呈較弱的胞膜染色為弱陽性(1+),≥10%瘤細胞有較弱但完整的胞膜著色或≤30%瘤細胞呈強且完整的胞膜著色為陽性(2+),>30%腫瘤細胞呈較強的完整細胞膜染色為強陽性(3+)。(2)her2基因檢測在10/40倍物鏡下觀察信號,選擇細胞核大小一致、核的邊界完整、DAPI染色均一、細胞核孤立無重疊、綠色著絲粒信號清晰的區(qū)域,在100倍物鏡下,通過特異的單通道濾光片隨機計數(shù)30個細胞內(nèi)信號。正常細胞:單個間期細胞核中紅色及綠色信號各2個。HER2基因擴增異常細胞:單個間期細胞核中紅色信號大于2個。Ratio值計算:Ratio值=30個細胞核中核中紅色信號總數(shù)/30個細胞核中綠色信號總數(shù),Ratio<1.8提示該樣本無HER2基因擴增;Ratio>2.2提示樣本中HER2基因擴增,若兩種信號的比值>20或眾多信號連接成簇時,可不用計算,即視為基因擴增;Ratio在1.8-2.2之間時,可以選擇增加計數(shù)細胞至100個,或者重新本次實驗來判斷最終結(jié)果。3.h檢測方法應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,FISH和ICH檢測方法采用kappa一致性檢驗分析;HER基因擴增與C-erbB-2蛋白表達陰/陽性率比較采用X2檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果1.個圖4C-erbB-2蛋白陽性信號位于細胞膜,HER2基因擴增為細胞核內(nèi)紅色信號大于2個(圖1-4)。58例乳腺癌中FISH檢測出HER2基因擴增17例,占29.3%,IHC檢測HER2蛋白有陽性信號者33例,占56.9%,其中陽性2+和3+共22例,占總病例的37.9%,C-erbB-2蛋白檢出率明顯高于HER2基因擴增。2.her2基因檢測結(jié)果本組IHC檢測C-erbB-2蛋白3+的12例中11例HER2基因擴增陽性,1例無擴增,C-erbB-2蛋白2+者10例,其中5例可見基因擴增,HER2蛋白1+者11例HER2基因擴增僅1例,C-erbB-2蛋白陰性病例共25例均未檢測到基因擴增。本組結(jié)果顯示IHC檢測C-erbB-2蛋白與FISH檢測HER2基因擴增狀態(tài)有較高的一致性且具有統(tǒng)計學意義(k=0.681,P=0.000);其中C-erbB-2蛋白陰性和3+病例與HER2基因擴增陰性和陽性率比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);而C-erbB-2蛋白1+和2+病例與HER2基因是否擴增(陰/陽性率比較)差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。ihc和fish的比較乳腺癌組織中有無HER2基因擴增和蛋白過度表達,對于判斷患者的預后、預測臨床療效以及選擇使用赫賽汀生物靶向治療有重要意義,因此準確檢測HER2基因和蛋白狀況極為關鍵。在多種檢測手段中,以IHC和FISH應用較多,FISH檢測目的物為相對穩(wěn)定的DNA,檢測過程較少受人為因素的影響,判讀標準客觀,可操作性強,特異性高,是檢測HER2基因擴增的金標準,但因價格昂貴,且對實驗設備要求高,一般實驗室難以開展。而IHC檢測物為CerbB-2蛋白,其特異性低于FISH法,但卻有較高的敏感性,由于IHC方法固有的特點及制片效果、判讀因素使不同醫(yī)院間的結(jié)果差異較大。因此現(xiàn)在較多研究者認為對于IHC檢查C-erbB-2蛋白陽性患者均應行FISH復查。本研究將IHC和FISH方法進行對比分析,希望尋找到最合理的復查模式。本組58例乳腺癌中有HER2基因擴增者17例,檢出率為29.3%,我們的IHC和FISH實驗分別在兩個獨立實驗室完成,在各自實驗結(jié)束后才進行結(jié)果比對,在蛋白表達為0和3+的病例,其與FISH檢測結(jié)果的符合率分別達到了100%(25/25)和91.7%(11/12),與國內(nèi)外研究結(jié)果一致。在C-erbB-2蛋白3+者12例中僅1例未發(fā)現(xiàn)相應的基因擴增,占無擴展病例的2.4%(1/41),在推測本例可能出現(xiàn)IHC結(jié)果假陽性時,也不能排除FISH實驗中偶爾產(chǎn)生的誤差情況。實驗表明這兩組病例IHC和FISH結(jié)果具有較高的一致性和吻合性(k=0.681,P<0.01),因此我們認為只要前期組織處理得當,IHC實驗嚴格質(zhì)量控制,對于IHC檢測C-erbB-2蛋白陰性標本無需再做FISH檢測;而IHC檢測C-erbB-2蛋白3+病例出現(xiàn)假陽性率極低,出于衛(wèi)生經(jīng)濟學的觀點,一般情況下不必強調(diào)增做FISH檢查。事實上IHC與FISH實驗結(jié)果對比主要集中在C-erbB-2蛋白表達1+和2+的病例,我們的這兩組病例C-erbB-2蛋白表達與HER2基因擴增陽性率比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),其結(jié)果的一致性和吻合性都存在明顯的差異,特別是2+病例組的誤差達到了50%(5/10),與國內(nèi)文獻報道C-erbB-2蛋白2+病例FISH陽性率為25%-76.19%結(jié)果一致。因此我們認為這類病人必須增做FISH檢查(尤其是C-erbB-2蛋白表達2+的病例),以