藥用植物羅漢果組培苗玻璃化研究

藥用植物羅漢果組培苗玻璃化研究

羅氏戈羅夫是中國獨特的腐殖藤本植物。這種水果經過處理，可以緩解咳嗽、粘液、潤腸排便等疾病。同時,羅漢果甜甙是一種低熱量高甜度的天然甜味劑,用途非常廣泛。近年來,我國越來越多的企業(yè)加入到生產羅漢果的行列,因此,羅漢果種苗(組培苗)市場需求量很大。為此一些科學工作者進行了羅漢果組培快繁研究,旨在探索其種苗的工廠化生產。然而在羅漢果組培快繁過程中,再生芽容易出現(xiàn)鮮綠透明的水漬狀,即玻璃化現(xiàn)象,玻璃化的苗由于組織畸形,分化能力降低,不易成活,因此不宜用作繼代和移栽的材料。玻璃化苗的成因很多,包括了培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件的影響等,本文對羅漢果組培苗玻璃化現(xiàn)象的影響因素進行了研究,以期為預防羅漢果玻璃化苗的產生和提高羅漢果組培苗的質量提供理論基礎和有效措施。1材料和方法1.1材料表面試驗材料為廣西壯族自治區(qū)藥用植物園選育并通過省級審定的青皮果系列羅漢果新品種永青1號。1.2菌株的培養(yǎng)和處理從試驗田里取羅漢果剛現(xiàn)蕾的幼嫩莖段,去掉較大的葉片,剪成1.0~2.0cm長的帶芽莖段,保留葉柄基部,在加有1%洗衣粉的洗滌液中浸泡5~8min,用細流水沖洗15min。在超凈工作臺上用75%酒精消毒10~40s,無菌水沖洗3次,0.1%升汞滅菌5min,無菌水沖洗4次。選擇不變色、無褐化的莖段橫切成面積約0.8cm×1.2cm的帶芽小塊,接種在MS+1.2mg/L6-BA+26g/L蔗糖+5.0g/L瓊脂的誘導培養(yǎng)基上,pH5.8,于25℃、光照時間為12h/d(日光燈,光照強度2000lx)的條件下培養(yǎng)3周后,選取健康無菌的叢生芽進行繼代培養(yǎng)。取繼代培養(yǎng)3周后的組培苗(株高1.5~2.0cm)接種于MS基本培養(yǎng)基,以6-BA濃度、蔗糖濃度、瓊脂濃度、培養(yǎng)溫度和光照時間為試驗因子,設置不同處理進行試驗。在添加0.5mg/L6-BA、4.5g/L瓊脂,蔗糖濃度設置20、25、30g/L的3種處理。在添加0.5mg/L6-BA、25g/L蔗糖,瓊脂濃度設置4.0、4.5、5.0g/L的3種處理。在添加25g/L蔗糖、4.5g/L瓊脂,6-BA的濃度設置0.1、0.5、1.0mg/L的3種處理。培養(yǎng)溫度設置22、26、30℃的3個處理。在光強2000lx下,光照時間設置10、12、14h/d的3個處理。每個處理接種15株苗,重復3次。培養(yǎng)20d后,觀察組培苗出現(xiàn)玻璃化的情況。2結果與分析2.1蔗糖濃度對羅漢果生長的影響糖作為碳源,除為細胞提供合成新化合物的碳骨架和能源之外,還起到維持一定滲透壓的作用。當蔗糖濃度為20g/L時,羅漢果組培苗玻璃化率高;蔗糖濃度為25g/L時,羅漢果分化植株健壯,叢生芽多顯著高于其他處理,玻璃化率顯著低于其他2個處理;蔗糖濃度為30g/L時,芽的分化受到抑制(表1)。2.2培養(yǎng)基玻璃化率隨用量的變化培養(yǎng)基中瓊脂的濃度直接影響培養(yǎng)基的硬度,硬度不同,植物對水分和營養(yǎng)物質吸收的程度就會不同,從而導致植物生長狀況的不同。本試驗隨著瓊脂濃度的增加,羅漢果組培苗的玻璃化率明顯下降,增殖系數(shù)也下降。當瓊脂濃度為4.0g/L時,培養(yǎng)基呈半固體狀,瓶苗葉片皺縮卷曲,呈不正常的水漬狀,玻璃化現(xiàn)象嚴重;當瓊脂濃度為4.5g/L時,羅漢果分化植株健壯,叢生芽多,玻璃化率相對較低;當瓊脂濃度為5.0g/L時,培養(yǎng)基中無玻璃化苗,但大部分組培苗出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象。方差分析結果顯示,瓊脂濃度對增殖總苗數(shù)、芽增殖系數(shù)有顯著影響,對玻璃化苗數(shù)及玻璃化率有極顯著影響(表2)。2.36不同濃度6-ba對芽增殖系數(shù)的影響不少研究報道,在組織培養(yǎng)增殖過程中,高濃度的6-BA會導致芽苗玻璃化,而使培養(yǎng)失敗。6-BA濃度為0.5mg/L時,芽增殖系數(shù)高,玻璃化率較低;6-BA濃度為0.1mg/L時,芽增殖系數(shù)低,同時出現(xiàn)不同程度的玻璃化現(xiàn)象;6-BA濃度為1.0mg/L時,芽增殖系數(shù)極低,易出現(xiàn)成塊的愈傷組織,說明芽擴增能力較差,即使有芽出來其玻璃化率也高。方差分析結果顯示,6-BA濃度對增殖總苗數(shù)、玻璃化苗數(shù)及玻璃化率均有極顯著影響(表3)。2.4培養(yǎng)溫度對羅馬林全學葉片化率的影響培養(yǎng)溫度為26℃時,組培苗玻璃化率最低,且增殖系數(shù)較高;培養(yǎng)溫度超過30℃時,玻璃化率有所增加;培養(yǎng)溫度低于22℃時,羅漢果植株生長緩慢,且芽增殖系數(shù)較低,玻璃化率比培養(yǎng)溫度為26℃時高,培養(yǎng)溫度低于18℃時,嚴重玻璃化,甚至萎蔫死亡。方差分析結果顯示,培養(yǎng)溫度對增殖總苗數(shù)影響極顯著,對玻璃化苗數(shù)和玻璃化率影響顯著(表4)。2.5光時間對羅地亞集體幼苗的玻璃化的影響3組培苗培養(yǎng)方面羅漢果組織培養(yǎng)中出現(xiàn)的玻璃化現(xiàn)象是許多因素作用的結果。綜合分析,確定以MS+0.5mg/L6-BA+25g/L蔗糖+4.5g/L瓊脂(pH5.8左右)的培養(yǎng)基上,并于26℃、光照時間為12h/d(日光燈,光照強度2000lx)的條件下進行組織培養(yǎng),羅漢果組培苗的增殖系數(shù)較高,玻璃化率較低,培養(yǎng)效果最好。研究表明,6-BA的濃度越高,玻璃化率越高,高濃度的6-BA使瓶苗玻璃化的原因可能與植物體內源激素的失衡以及6-BA促進細胞分裂過快而細胞內干物質合成與積累跟不上有關,加上羅漢果組培苗本身對激素量也較為敏感,本試驗中6-BA濃度以0.5mg/L為最佳。蔗糖對培養(yǎng)基的滲透壓起決定性作用。玻璃化現(xiàn)象的發(fā)生是組培苗不適應培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境的結果。適當提高蔗糖的濃度,降低培養(yǎng)基的滲透勢,可對培養(yǎng)物造成水分脅迫以降低玻璃化。從該試驗結果來看,蔗糖濃度為25g/L時,羅漢果組培苗生長最好。瓊脂也影響培養(yǎng)基中可利用水分的量,瓊脂濃度低時,培養(yǎng)基水分過多,培養(yǎng)瓶濕度過大,組培苗易產生玻璃化,且易倒伏。瓊脂濃度過高,培養(yǎng)基太硬,營養(yǎng)物質難以被組培苗吸收利用,芽的分化力降低,該試驗瓊脂濃度以4.5g/L為最佳用量。植物組織培養(yǎng)所需溫度一般在(25±2)℃,該研究結果表明,當培養(yǎng)溫度為22~26℃時,玻璃化率最低。植物組織培養(yǎng)過程中,一般每個培養(yǎng)架按層數(shù)不同每層使用一只40W日光燈,要求光照時間為10~12h/d。此外,若有可能增加自然光照,玻璃化現(xiàn)象會逐漸消失。該試驗結果表明,光照時間為12h/d時,羅漢果組培苗的生長最好。總之,通過綜合調控羅漢果的組織培養(yǎng)條件,可以有效預防和減少玻璃