基因工程-第9章-外源基因的表達(dá)1

第九章外源基因的表達(dá)基因表達(dá)(geneexpression)就是指某一基因指導(dǎo)下的蛋白質(zhì)合成，蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的產(chǎn)物?？寺』虮磉_(dá)方面的研究成果，對于某些研究領(lǐng)域有著重要的用途。首先，它有可能為揭示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系提供新的研究手段。例如，運(yùn)用重組DNA技術(shù)，能夠獲得可在大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行有效表達(dá)的雜種干擾素的編碼基因。這樣，便可以將這種蛋白質(zhì)分子純化出來，在體外進(jìn)行生物學(xué)方面的研究。

利用基因工程技術(shù)將真核基因轉(zhuǎn)至原核生物中，由于原核生物繁殖速度快，因此一些用傳統(tǒng)和常規(guī)方法不能或難以大量生產(chǎn)的有生理活性的蛋白，如果采用“工程菌”來生產(chǎn)就方便得多。例如生長激素釋放抑制因子從50萬只羊腦中僅能提取出5mg，而現(xiàn)在用10L的工程菌液即能提出來。用720kg豬胰臟只能夠提取出100mg胰島素，而用2000L工程菌發(fā)酵液即可得到同樣量的胰島素。從這些例子中可以看到基因工程在應(yīng)用方面的巨大潛力。

9.1外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)9.1.1原核生物基因表達(dá)的特點(diǎn)同所有的生命過程一樣，外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)包括兩個(gè)主要過程：即DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA和mRNA翻譯成蛋白質(zhì)。與真核細(xì)胞相比，原核細(xì)胞的表達(dá)有以下特點(diǎn)：①原核生物只有一種RNA聚合酶(真核細(xì)胞有三種)識別原核細(xì)胞的啟動(dòng)子，催化所有RNA的合成。②原核生物的表達(dá)是以操縱子為單位的。操縱子是數(shù)個(gè)相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因及其調(diào)控區(qū)的結(jié)合，是一個(gè)基因表達(dá)的協(xié)同單位。調(diào)控區(qū)主要分為三個(gè)部分：操縱子(operator)、啟動(dòng)子(promotor)及其他有調(diào)控功能的部位。

③由于原核生物無核膜，所以轉(zhuǎn)錄與翻譯是偶聯(lián)的，也是連續(xù)進(jìn)行的。原核生物染色體DNA是裸露的環(huán)形DNA，轉(zhuǎn)錄成mRNA后，可直接在胞漿中與核糖體結(jié)合翻譯形成蛋白質(zhì)。④原核基因一般不含有內(nèi)含子(intron)，在原核細(xì)胞中缺乏真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)。⑤原核生物基因的控制主要在轉(zhuǎn)錄水平，這種控制要比對基因產(chǎn)物的直接控制要慢。對RNA合成的控制有兩種方式，一是起始控制(啟動(dòng)子控制)，二是終止控制(衰減子控制)。⑥在大腸桿菌mRNA的核糖體結(jié)合位點(diǎn)上，含有一個(gè)轉(zhuǎn)譯起始密碼子及同16S核糖體RNA3’末端堿基互補(bǔ)的序列，即S-D序列，而真核基因則缺乏此序列。欲將外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)，必須考慮表達(dá)載體、外源基因的性質(zhì)、原核細(xì)胞的啟動(dòng)子和S-D序列、閱讀框架及宿主菌調(diào)控系統(tǒng)等基本條件，也就是說必須滿足以下條件：①通過表達(dá)載體將外源基因?qū)胨拗骶?，并指?dǎo)宿主菌的酶系統(tǒng)合成外源蛋白；②外源基因不能帶有間隔順序(內(nèi)含子)，因而必須用cDNA或全化學(xué)合成基因，而不能用基因組DNA(genomicDNA)；③必須利用原核細(xì)胞的強(qiáng)啟動(dòng)子和S-D序列等調(diào)控元件控制外源基因的表達(dá)；④外源基因與表達(dá)載體連接后，必須形成正確的開放閱讀框架(openreadingframe)；⑤利用宿主菌的調(diào)控系統(tǒng)，調(diào)節(jié)外源基因的表達(dá)，防止外源基因的表達(dá)產(chǎn)物對宿主菌的毒害。

9.1.2基因表達(dá)的調(diào)控序列如上所述，由于原核和真核細(xì)胞中基因表達(dá)的機(jī)制是不同的，因此必須詳細(xì)了解基因表達(dá)過程中的各種調(diào)控因子，構(gòu)建高效的表達(dá)載體，才能達(dá)到高效率、高水平表達(dá)外源基因的目的。對原核生物來講，基因表達(dá)的調(diào)控序列主要涉及啟動(dòng)子、S-D序列、終止子、衰減子等序列。1.啟動(dòng)子

啟動(dòng)子是DNA鏈上一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表達(dá)不可缺少的重要調(diào)控序列。沒有啟動(dòng)子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。原核生物啟動(dòng)子是由兩段彼此分開且又高度保守的核苷酸序列組成，對mRNA的合成極為重要。Pribnow盒，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游5～10bp，一般由6～8個(gè)堿基組成，富含A和T，故又稱為TATA盒或—10區(qū)。啟動(dòng)子來源不同，Pribnow盒的堿基順序稍有變化。-35區(qū)，位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游35bp處，故稱-35區(qū)，一般由10個(gè)堿基組成。一般認(rèn)為，-35區(qū)是RNA聚合酶σ亞基的識別與結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)σ亞基附著在-35區(qū)后，便帶動(dòng)RNA聚合酶的核心酶(coreenzyme，無σ亞基的RNA聚合酶)沿DNA鏈向轉(zhuǎn)錄起始方向滑動(dòng)至Pribnow盒，并與之接觸，而一旦它們相互結(jié)合之后，σ亞基就從最左邊的識別位點(diǎn)上解離下來。

(1)lac啟動(dòng)子lac啟動(dòng)子是來自大腸桿菌的乳糖操縱子。lac操縱子模型最初由Jacob和Monod于1961年提出，它是DNA分子上一段有方向的核苷酸順序，即由阻遏蛋白基因，(lacI)、啟動(dòng)基因(啟動(dòng)子P)、操縱基因(O)和編碼3個(gè)與乳糖利用有關(guān)的酶的結(jié)構(gòu)基因所組成(圖8-2)。(2)trp啟動(dòng)子trp啟動(dòng)子可從大腸桿菌的色氨酸操縱子中分離。色氨酸操縱子結(jié)構(gòu)基因排列及其表達(dá)如圖8-3所示。

(3)PL和PR啟動(dòng)子PL和PR啟動(dòng)子是指從λ噬菌體中得到的一類啟動(dòng)子，它比lac啟動(dòng)子活性高8-10倍。λ噬菌體有自己的一套阻遏物-操縱基因系統(tǒng)(圖8-4)。(4)tac啟動(dòng)子tac啟動(dòng)子是一組由非常強(qiáng)的trp和lac啟動(dòng)子人工構(gòu)建的雜合啟動(dòng)子。它比lacUV5啟動(dòng)子強(qiáng)7倍。其中tacI是由trp啟動(dòng)子的-35和lacUV5的-10區(qū)構(gòu)成；tacⅡ是由trp啟動(dòng)子的-35區(qū)加上一個(gè)合成的46bpDNA片段(包括Pribnow盒區(qū))和lac基因所構(gòu)成；tacl2是由trp的-35區(qū)和lac的-10區(qū)，再加上lac操縱子中的操縱基因部分和S-D序列融合而成的，它受1ac阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控，并被IPTG誘導(dǎo)。

2．S-D序列mRNA在細(xì)菌中的轉(zhuǎn)譯效率依賴于是否有核糖體結(jié)合位點(diǎn)的存在，即S-D序列以及S-D序列與起始密碼子AUG之間的距離。在原核細(xì)胞中，當(dāng)mRNA結(jié)合到核糖體上后，翻譯或多或少會自動(dòng)發(fā)生。細(xì)菌在翻譯水平上的調(diào)控是不嚴(yán)格的，只有RNA和核糖體的結(jié)合才是蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵。1974年Shine和Dalgarno首先發(fā)現(xiàn)，在mRNA上有核糖體的結(jié)合位點(diǎn)，它們是起始密碼子AUG和一段位于AUG上游3-10bp處的由3-9bp組成的序列。這段序列富含嘌呤核苷酸，剛好與16SrRNA3’末端的富含嘧啶的序列互補(bǔ)，是核糖體RNA的識別與結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)發(fā)現(xiàn)者的名字，命名為Shine-Dalgarno序列，簡稱S-D序列。3．終止子在一個(gè)基因的3’端或是一個(gè)操縱子的3’端往往還有一特定的核苷酸序列，它有終止轉(zhuǎn)錄的功能，這一DNA序列稱為轉(zhuǎn)錄終止子，簡稱終止子(terminator)。轉(zhuǎn)錄終止過程包括：①RNA聚合酶停留在DNA模板上不再前進(jìn)，RNA的延伸也停止在終止信號上；②完成轉(zhuǎn)錄的RNA從RNA聚合酶上釋放出來；③RNA聚合酶從模板上釋放出來。對RNA聚合酶起終止作用的終止子在結(jié)構(gòu)上有一些共同的特點(diǎn)，即有一段富含A/T的區(qū)域和一段富含G／C的區(qū)域，G／C富含區(qū)域又具有回文對稱結(jié)構(gòu)，這段終止子轉(zhuǎn)錄后形成的RNA具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并且具有與A/T富含區(qū)對應(yīng)的一串U。4．衰減子

衰減子(attenuator)是指在某些前導(dǎo)序列中帶有控制蛋白質(zhì)合成速率的調(diào)節(jié)區(qū)。在原核生物中，一條mRNA分子常常編碼數(shù)種不同的多肽鏈。這種多順反子mRNA的頭一條多肽鏈合成的起始點(diǎn)，同RNA分子的5’-P末端間的距離可達(dá)數(shù)百個(gè)核苷酸。這段位于編碼區(qū)之前的不轉(zhuǎn)譯的mRNA區(qū)段，叫做前導(dǎo)序列(1eader)。此外，在mRNA的3'-OH末端，以及在多順反子mRNA中含有的長達(dá)數(shù)百個(gè)堿基的順反子間序列(intercistranic-sequence)，即間隔序列(spacer)，也發(fā)現(xiàn)有不轉(zhuǎn)譯的序列。

9.1.3幾種類型的原核表達(dá)載體非融合蛋白：不與細(xì)菌的任何蛋白或多肽融合在一起的表達(dá)蛋白稱為非融合蛋白。非融合蛋白的優(yōu)點(diǎn)在于它具有非常接近于真核細(xì)胞體內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，因此表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)功能也就更接近于生物體內(nèi)天然蛋白質(zhì)。非融合蛋白的最大缺點(diǎn)是容易被細(xì)菌蛋白酶所破壞。融合蛋白：融合蛋白是指蛋白質(zhì)的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列編碼，C端由真核DNA的完整序列編碼。這樣的蛋白質(zhì)由一條短的原核多肽或具有其他功能的多肽和真核蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，故稱為融合蛋白。含原核細(xì)胞多肽的融合蛋白是避免細(xì)菌蛋白酶破壞的最好措施?；蚬こ痰妮d體有克隆載體和表達(dá)載體之分。克隆載體中都有一個(gè)松弛型復(fù)制子，能帶動(dòng)外源基因在受體細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增。表達(dá)載體是適合在受體細(xì)胞中表達(dá)外源基因的載體。1.非融合型表達(dá)蛋白載體pKK223-3這個(gè)載體是由Brosius等在哈佛大學(xué)的Gilbert實(shí)驗(yàn)室組建的。在大腸桿菌細(xì)胞中，它能極有效地高水平表達(dá)外源基因。它具有一個(gè)強(qiáng)的tac(trp-lac)啟動(dòng)子。這個(gè)啟動(dòng)于是由trp啟動(dòng)子的-35區(qū)、lacUV5啟動(dòng)子的-10區(qū)、操縱基因及S-D序列組成。在lacI宿主(如JMl05)，tac啟動(dòng)子受阻遏，但只要在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候加上IPTG，就可去阻遏。如圖8-7所示，緊接tac啟動(dòng)子的是一個(gè)取自pUC8的多位點(diǎn)接頭(polylinker)，使之很容易把目的基因定位在啟動(dòng)子和S-D序列后。在多位點(diǎn)下游的一段DNA序列中，還包含一個(gè)很強(qiáng)的rrnB核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄終止子，目的是為了穩(wěn)定載體系統(tǒng)。因?yàn)樯嫌螐?qiáng)的tac啟動(dòng)子控制的轉(zhuǎn)錄必須由強(qiáng)終止子抑制，才不至于