光譜核型分析技術(shù)在染色體檢測中的應(yīng)用

光譜核型分析技術(shù)在染色體檢測中的應(yīng)用

染色突變是輻射損傷的評估指標(biāo)。通過對人類血巴氏合金譜損傷的分析計算，我們可以對患者在核事故發(fā)生時的輻射劑量進行估計。細胞遺傳學(xué)檢查方法之一的染色體核型分析技術(shù)因其實用性,已經(jīng)成為染色體異常的常規(guī)篩選技術(shù)。但是利用傳統(tǒng)的G、R、Q帶通常無法檢測到染色體結(jié)構(gòu)上的細微變異,更難以獲得精確的結(jié)果。熒光原位雜交(FluorescenceInSituHybridization,FISH)技術(shù)具有高度的敏感性和特異性,已成為另一有力的細胞遺傳學(xué)研究工具,并與核型分析互相補充聯(lián)合應(yīng)用。Burak等用FISH技術(shù)檢驗核工廠工人血淋巴細胞慢性輻射照射的易位發(fā)生率。Kodama等用FISH技術(shù)對染色體畸變分析估計輻射劑量,繪制生物效應(yīng)曲線,認(rèn)為這種技術(shù)對早期受照者劑量估算或重建比常規(guī)法更為敏感。隨著探針制備的完善與發(fā)展,進一步衍生出染色體涂抹(chromosomepainting,CP)、比較基因組雜交(comparativegenomichybridization,CGH)及反向染色體涂抹(reverseCP,RCP)等技術(shù)。這些技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用,豐富了細胞遺傳學(xué)研究內(nèi)容,使細胞遺傳學(xué)向分子領(lǐng)域發(fā)展,并在臨床和科研工作中得到廣泛應(yīng)用。在FISH技術(shù)基礎(chǔ)上又發(fā)展出多色熒光原位雜交技術(shù):光譜核型分析(spectralkaryotyping,SKY)、多重FISH(M-FISH)和彩色顯帶FISH(Rx-FISH),它們一次成像可同時區(qū)分24條染色體,使復(fù)雜染色體異常的篩查成為可能,并且都能顯示相當(dāng)多的數(shù)目和復(fù)雜結(jié)構(gòu)的改變。尤其是當(dāng)基因變異發(fā)生在與G帶(G-banding)極為相似的染色體片段時,應(yīng)用SKY技術(shù)就能作出快速而準(zhǔn)確的診斷,更可以揭示常規(guī)分析方法難以識別的穩(wěn)定性畸變?nèi)缫孜?、重排和一些未知來源的?biāo)記染色體。SKY技術(shù)對輻射損傷、人群放射性監(jiān)護中輻射劑量的快速測定和快速估算有著廣泛的應(yīng)用前景,SKY技術(shù)檢測染色體異?？勺鳛橹委煴O(jiān)測和隨訪過程中檢測微小殘留病變的有效指標(biāo)。因此,現(xiàn)在SKY技術(shù)已經(jīng)被公認(rèn)為準(zhǔn)確、高效的細胞遺傳學(xué)研究方法。本文主要介紹SKY的方法及原理。1材料和方法1.1材料表面1.1.1探針池的制備SKY探針是由24種人類染色體涂染探針的混合物。其中每種探針分別用5種熒光素的不同組合進行標(biāo)記,制備成探針池。humanSpectralkaryotypingReagent和SkyPaintTM試劑盒購于美國AppliedSpectralImaging公司。1.1.2ssc的稀釋RNA酶、胃蛋白酶、甲酰胺(去離子)、Tween-20(Sigma公司),RPMI1640(GIBCO公司),DAPI、rubbercement(美國VYSIS公司),20×SSC貯存液(NaCl174g,檸檬酸鈉88.2g,三次蒸餾水配成1000mL)稀釋成1×SSC、2×SSC、4×SSC應(yīng)用液備用。1.1.3儀器SKY(SpectralKaryotyping)染色體圖像自動分析儀(德國Leice公司)。1.2方法1.2.1體外膜消化劑的制備(1)染色體標(biāo)本的制備:參照國家標(biāo)準(zhǔn)《染色體畸變分析法估算生物劑量的方法》(GB/T12715-1991)進行細胞培養(yǎng),收獲進行低滲、固定、制片。于清潔干燥處,老化1周;(2)將標(biāo)本在RNA酶溶液(100μg/mL)37℃孵育1小時,然后在2×SSC溶液中洗3次,每次5min,分別用70%、85%、100%乙醇溶液進行梯度脫水,自然干燥;(3)消化及固定:在含有0.01mmol/LHCL的胃蛋白酶(10mg/L)溶液中消化染色體標(biāo)本5min,2×SSC洗滌,分別用70%、85%、100%乙醇溶液進行梯度脫水,自然干燥;(4)標(biāo)本變性:在70%甲酰胺/2×SSC溶液中于66～72℃變性1.5min,立即放入70%、85%、100%冷乙醇溶液中進行梯度脫水,自然干燥。1.2.2介入變量取8μLSKY探針90℃水浴5min,再立即冰浴5min,37℃下預(yù)雜交30min。1.2.3密封與密封變性后的探針加入標(biāo)記好的雜交區(qū),放置蓋玻片(15mm×15mm),用橡膠粘合劑(rubbercement)密封,并于濕潤的容器內(nèi)37℃孵育36小時。1.2.4熒光素染料法小心去除雜交時放置的蓋玻片和橡膠粘合劑,在37℃預(yù)熱的50%甲酰胺/2×SSC(以2×SSC為溶液配置50%的甲酰胺,pH=7.0)中洗滌5min;繼之用2×SSC,1×SSC溶液各洗一次,每次5min;加200μL的3%脫脂奶粉/4×SSC/0.1%Tween20(100mL4×SSC中加入0.1mLTween20及3g脫脂奶粉),洗3次,每次2min;載玻片雜交區(qū)域滴加20μLCy5熒光素染料、加蓋玻片(15mm×15mm),濕盒37℃孵育60min,4×SSC/0.1%Tween-20,室溫洗3次,每次2min。再加20μLCy5.5染料,孵育洗滌同上。操作時注意避光。1.2.5特芬那加二氨基苯基吲哚(DAPI),每片15μL;直接封片15分鐘觀察結(jié)果。2結(jié)果與分析2.1全染色體的熒光顯微觀察SKY是一種波譜影像分析方法,它運用了光譜干涉儀(interferometer)及傅立葉變換(Fouriertransform),將圖像中每一象素做光譜分析后再重新顯示,增強了對多種熒光分析的辨別。24種全染色體涂染探針先用5種不同的熒光素組合進行不同的標(biāo)記,然后將探針混合物與中期染色體進行原位雜交,通過熒光顯微鏡獲得熒光圖像并進行光譜成像。其結(jié)果分顯色圖像和分色圖像兩部分,前者可于圖像獲取后即刻評估所有探針的雜交質(zhì)量;后者用特定的SKY軟件,參照每一條染色體特有的光譜信息特征進行分析。SKY技術(shù)可同時觀察和分析人類24條染色體或小鼠21條染色體,同一張圖像呈現(xiàn)不同顏色。SKY能夠發(fā)現(xiàn)經(jīng)典遺傳學(xué)技術(shù)和單獨用FISH技術(shù)所不能發(fā)現(xiàn)的細微的染色體異常,清楚地鑒別染色體的重排,特別是易位、插入及可以產(chǎn)生標(biāo)記染色體的許多復(fù)雜的染色體結(jié)構(gòu)改變,對于各種標(biāo)記染色體的來源也一目了然,補充了傳統(tǒng)顯帶和FISH技術(shù),使細胞遺傳學(xué)的診斷更加穩(wěn)定和精確。2.2基于daps的核型分析SKY是應(yīng)用一種在多個光譜上有重疊的全染色體涂染探針,使發(fā)射光譜的所有信息用于分析。首先熒光顯微鏡獲得染色體標(biāo)本的熒光圖像并進行光譜成像。然后,光線通過光譜干涉儀聚焦在數(shù)字?jǐn)z像頭上,獲得每一個像素的干涉圖像,接著形成一個三維的數(shù)據(jù)庫并得到每個像素的光程差與強度的對應(yīng)曲線,然后通過傅立葉轉(zhuǎn)換,及SKYView軟件分類,通過一種光譜分類計算法將一特定的分類色(偽色)分配到所有的人類染色體上,根據(jù)DAPI染色分辨出一個中期分裂相中所有染色體,這樣在計算機屏幕上可以看到每對染色體分別由光譜產(chǎn)生的顏色、灰值編碼和計算機模擬色。不同的染色體顯示出不同的偽色,便可通過染色體顏色的不同進行核型分析。圖1是采用光譜核型分析方法獲取的一例肝癌患者的腫瘤組織較典型的染色體圖形。圖中81條染色體為近四倍體,從X、Y到常染色體每條染色體均有不同程度的丟失,大多數(shù)的染色體形成復(fù)雜易位,5號染色體二條短臂頂端出現(xiàn)了22號染色體標(biāo)記小體。在一個中期分裂相上就能發(fā)現(xiàn)染色體的易位、丟失、缺失、重排、擴增、雙著絲粒、等臂以及標(biāo)記小體等現(xiàn)象。由此圖可說明即使細微的染色體異常在SkyVisionTM下都將無所遁形。3融資約束與染色體異常的診斷價值及體會1999年4月在西班牙Sitges市召開了有關(guān)熒光原位雜交(FISH)技術(shù)生物劑量計問題的國際會議,認(rèn)為FISH技術(shù)已經(jīng)開啟了快速、可靠檢測穩(wěn)定性染色體畸變,并能準(zhǔn)確推算生物劑量。當(dāng)受到長期低劑量輻射所致的染色體損傷時,主要表現(xiàn)在體細胞DNA靶分子上,引起DNA雙鏈斷裂和其后的錯誤修復(fù),使中期染色體發(fā)生畸變,從而導(dǎo)致抑癌基因的缺失和原癌基因的激活性突變。突變的單個細胞失去正常繁殖控制,形成克隆化生長,這些染色體畸變隨照射后時間延長減少。相反,穩(wěn)定型畸變?nèi)缫孜坏饶軌蜷L期存留。同時,染色體的變化對癌基因的定位、早期診斷和鑒別診斷、治療及預(yù)后的評價具有重要的意義。但是FISH技術(shù)也有其局限性,首先它只能用特異性的探針檢測已知染色體的異常,其次能夠同時檢測的目標(biāo)數(shù)受限于探針數(shù),況且信號之間會互相干擾,因此FISH技術(shù)不能作為染色體異常的篩選試驗。SKY是目前唯一能夠揭示檢測G帶變異的彩色核型分析技術(shù),它使惡性腫瘤染色體異常的診斷達到前所未有的準(zhǔn)確。只有SKY才能真正做到只用一組熒光濾鏡,只做一次雜交反應(yīng)便可得到全部染色體的核型,它是目前為止精確度、靈敏度最高的染色體分析技術(shù)。SKY適用于鑒別與特殊表型相關(guān)的新型多發(fā)染色體異常,也可用于評價治療的療效和疾病的愈后。在疾病初發(fā)和治療前檢測有否分子遺傳學(xué)異常非常重要,較多異常染色體的出現(xiàn),常常提示染色體組的不穩(wěn)定,往往和疾病的進展和侵襲相關(guān)。SKY技術(shù)檢測染色體異常可作為治療監(jiān)測和隨訪過程中檢測微小殘留病變的有效指標(biāo),SKY技術(shù)為相關(guān)基因的克隆及癌癥的發(fā)病機制的研究提供了更先進和有效的方法。要得到一張滿意的SKY染色體標(biāo)本并不容易,在制片、雜交、觀察等方法需要有一定的技術(shù)和經(jīng)驗。我們的體會是:(1)滴片老化后細胞要用RNA酶及胃蛋白酶進行消化,以去掉周圍的蛋白質(zhì),保證雜交的通透性。梯度洗脫時要注意pH值(pH=7.0),充分振蕩,盡量將雜質(zhì)洗脫,減少背景噪聲和探針非特異