熒光原位雜交技術(shù)在細(xì)胞免疫檢測(cè)中的應(yīng)用

熒光原位雜交技術(shù)在細(xì)胞免疫檢測(cè)中的應(yīng)用

自1988年giovannoni首次使用rrna-rna相關(guān)信息來(lái)探索微觀(guān)細(xì)胞外的細(xì)菌以來(lái)，隨著熒光技術(shù)的發(fā)展，燈絲研究所首次應(yīng)用了熒光標(biāo)記相關(guān)信息來(lái)探索獨(dú)立的微生物細(xì)胞。該技術(shù)是一種直接原位異構(gòu)熒光育種技術(shù)（fish）。它不僅可以通過(guò)在環(huán)境樣品上直接原位異建，而且可以通過(guò)原位異構(gòu)育種方法測(cè)定不能培養(yǎng)的微生物的形態(tài)特征和豐度，還可以進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)分析，而且可以進(jìn)行空間和數(shù)量分布。由于它的良好測(cè)量過(guò)程中不破壞細(xì)胞及其形狀，特異性強(qiáng)、分辨率高、安全、速度快等優(yōu)點(diǎn)，因此在環(huán)境微生物領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。1fish技術(shù)介紹1.1fish的基本原理FISH(fluorescentin-situhybridization)是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù),其利用核糖體內(nèi)長(zhǎng)度適中(約1500bp)、高度保守的16SrRNA序列作為理想的基因分類(lèi)靶序列,根據(jù)16SrRNA序列的保守性和特異性設(shè)計(jì)所需要的不同分類(lèi)級(jí)別的寡核苷酸探針,識(shí)別特異核苷酸序列的帶標(biāo)記的一段單鏈DNA或RNA分子,該探針與待測(cè)靶DNA同源互補(bǔ),經(jīng)變性—退火—復(fù)性形成靶DNA與核酸探針的雜交體。FISH中使用的16SrRNA寡核苷酸探針,一般是進(jìn)行了熒光標(biāo)記的20bp左右特異性核苷酸片段,利用該報(bào)告分子(如生物素、地高辛)與熒光素標(biāo)記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng),經(jīng)熒光檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)待測(cè)DNA進(jìn)行定性、定量或相對(duì)定位分析。FISH技術(shù)作為一種非放射性檢測(cè)體系,具有如下優(yōu)點(diǎn):(1)FISH采用非放射性的生物素標(biāo)記探針,不存在輻射型污染問(wèn)題。(2)熒光探針經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定,一次標(biāo)記后可在2年內(nèi)使用,且只要具有熒光顯微鏡,一般常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室均可進(jìn)行。(3)該技術(shù)基于抗體、抗原鑒特異性識(shí)別與結(jié)合等特點(diǎn),實(shí)驗(yàn)周期短、特異性好、靈敏度高、定位準(zhǔn)確,定位長(zhǎng)度在1kb的DNA序列的靈敏度與放射性探針相當(dāng)。(4)多色FISH可同時(shí)檢測(cè)多種序列,應(yīng)用范圍極其廣泛。1.2fish技術(shù)的主要步驟FISH主要操作流程如圖1。1.3新技術(shù)的發(fā)展目前FISH技術(shù)經(jīng)過(guò)不斷的豐富和完善,已經(jīng)形成多色熒光原位雜交(multicolorfluorescenceinsituhybridization)、DNA纖維-熒光雜交技術(shù)(DNAfiberFISH)、基因組原位雜交(genomeinsitusuppression,GISH)等一系列新技術(shù)。1.3.1ssr標(biāo)記定位多色熒光原位雜交技術(shù)的最大特點(diǎn)就是可利用不同顏色的熒光分子標(biāo)記不同的探針,同時(shí)對(duì)不同的靶DNA在同一標(biāo)本上進(jìn)行定位,即一次雜交檢測(cè)多個(gè)靶位。但由于不同熒光分子的光譜重疊,一般只能同時(shí)使用3種不同顏色。為擴(kuò)大FISH容量,近年來(lái)發(fā)展了組合標(biāo)記、比例標(biāo)記、多色染色體涂色等方法標(biāo)記更多探針。1.3.2調(diào)整染色質(zhì)結(jié)構(gòu),提高fps鑒于FISH技術(shù)分辨率低等問(wèn)題,DNA纖維-FISH技術(shù)利用化學(xué)方法對(duì)染色體進(jìn)行線(xiàn)性化,改變?nèi)旧|(zhì)原有空間結(jié)構(gòu),降低DNA濃縮程度,從而提高FISH分辨率。與普通FISH技術(shù)相比,DNA纖維-熒光雜交技術(shù)具有分辨率和靈敏度高,可直接確定不同DNA序列間排列關(guān)系、模板要求不高、只需少量DNA分子即可進(jìn)行DNA定量分析等優(yōu)點(diǎn)。1.3.3近親緣關(guān)系探針技術(shù)原位雜交技術(shù)直接利用特異性DNA作為分子探針,可對(duì)近親緣性關(guān)系的分類(lèi)群之間基因組關(guān)系進(jìn)行研究,也可直接利用全部基因組DNA作為探針,從而鑒定動(dòng)植物全部的親本基因組,該技術(shù)快速、靈敏、準(zhǔn)確。2生物菌群的特性已有的微生物群落結(jié)構(gòu)、功能、分布及其生態(tài)學(xué)等研究結(jié)果僅表明混合菌群具有較高的生物多樣性,但只有非常少的微生物被分離和鑒定,而只有了解微生物單一菌株功能特性、混合菌群多樣性以及微生物結(jié)構(gòu)的形成特性,才能提高對(duì)環(huán)境處理系統(tǒng)的控制能力。因此,結(jié)合FISH技術(shù)用于環(huán)境微生物的研究,可用以研究環(huán)境微生物生態(tài)系統(tǒng)的組成、結(jié)構(gòu)與功能,尤其是具有特殊分層結(jié)構(gòu)、多樣化代謝菌群共存與協(xié)同偶合等特性的顆粒污泥,對(duì)于深層次了解環(huán)境微生物種群關(guān)系、群落結(jié)構(gòu)與處理效率的相關(guān)性,進(jìn)一步提高廢水處理效率具有重要的理論和實(shí)用意義。2.1基于fish的硝化細(xì)菌檢測(cè)硝化菌和氨氧化菌的數(shù)量及空間分布與微生物在硝化/反硝化過(guò)程中所處的階段相關(guān),因此對(duì)生物處理系統(tǒng)中硝化菌及氨氧化菌的研究是調(diào)控廢水脫氮工藝運(yùn)行的重要參數(shù)。由于硝化細(xì)菌是一類(lèi)生理上非常特殊的化能自氧菌,傳統(tǒng)的研究方法要經(jīng)過(guò)富集、分離、分類(lèi)和鑒定步驟,耗時(shí)長(zhǎng),且因所用的培養(yǎng)基有選擇性使得某些易于培養(yǎng)的菌株,如Nitrosomonaseuropaea和Nitrobacterwinogradskyi等超過(guò)了其他硝化細(xì)菌,使得到的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群與樣品真實(shí)情況有差異。FISH技術(shù)的引入解決了上述困難,Wagner和Bruce等較早將FISH技術(shù)應(yīng)用于硝化細(xì)菌檢測(cè),并建立了一套較完善的硝化細(xì)菌FISH檢測(cè)方法,之后隨著人工設(shè)計(jì)合成的硝化細(xì)菌及氨氧化菌探針的不斷推出,FISH技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于活性污泥系統(tǒng)、硝化流化床反應(yīng)器和膜生物反應(yīng)器等污水處理系統(tǒng)中。Juretschkoetal.(2002)對(duì)硝化流化床、普通活性污泥等工藝的活性污泥中硝化細(xì)菌的多樣性采用FISH法進(jìn)行了跟蹤分析,發(fā)現(xiàn)Nitrosospira、Nitrospira為優(yōu)勢(shì)菌種,但未檢測(cè)到Nitrosomonas和Nitrobacter,在對(duì)多個(gè)工業(yè)廢水處理廠(chǎng)利用活性污泥工藝處理工業(yè)廢水的探測(cè)中發(fā)現(xiàn),Nitrosomonas氨氧化菌占DAPI染色總菌數(shù)的16%～20%,探針S-3*-Ntspa-1026-aA-18檢測(cè)到的Nitrospira硝化細(xì)菌占細(xì)胞總數(shù)的9%。考慮到顆粒污泥的特殊結(jié)構(gòu)特性,具有一定粒徑的顆粒污泥由于氧擴(kuò)散梯度的存在,其內(nèi)部形成缺氧或厭氧區(qū)域,因此在好氧條件下構(gòu)成了有利于同步硝化反硝化的微觀(guān)環(huán)境,加上序批式反應(yīng)器獨(dú)特的厭氧/兼氧-好氧交替反應(yīng),可在顆粒污泥外層和內(nèi)部同步實(shí)現(xiàn)硝化和反硝化。因此,近年來(lái)FISH逐漸被應(yīng)用于顆粒污泥的微生物結(jié)構(gòu)和種群分布的研究中。Tsunedaetal(2003)通過(guò)DGGE和FISH(以Cy5標(biāo)記的EUB338、TRITC標(biāo)記的NSO190與FITC標(biāo)記的NIT3等作為探針)對(duì)好氧流化床反應(yīng)器(AUFB)內(nèi)硝化顆粒污泥的分析發(fā)現(xiàn),氨氧化菌作為顆粒污泥內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌,主要分布于顆粒外層,同時(shí)在顆粒表面存在少量亞硝酸鹽氧化菌。2.2生物除磷微生物脫氮除磷工藝在廢水處理工程中被廣泛應(yīng)用,特別是強(qiáng)化除磷(EBPR)工藝,對(duì)污水除磷效果十分顯著。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者利用分子雜交技術(shù)對(duì)不同除磷工藝中聚磷菌的生態(tài)變化進(jìn)行了大量研究。FISH技術(shù)的應(yīng)用克服了以往除磷菌難以用常規(guī)方法培養(yǎng)造成的研究上的困難,并對(duì)不同條件下生物除磷工藝的改進(jìn)起到了指導(dǎo)性的作用。Mamoru對(duì)強(qiáng)化除磷(EBPR)工藝的FISH研究中,無(wú)論好氧或厭氧區(qū)的活性污泥中都存在豐富的除磷微生物,其中常見(jiàn)類(lèi)群為BetProteobacteria亞類(lèi)的Actinobacteria、GPBHGC、Epbr15和Epbr16等。在好氧顆粒污泥研究方面,Meyeretal(2003)報(bào)道了在厭氧-好氧交替運(yùn)行的SBR反應(yīng)器內(nèi)形成了與生物除磷有關(guān)的聚糖原菌(Glycogenaccumulatingorganisms)顆粒污泥,以EUBMIX(細(xì)菌)、GAOQMIX(Competibacter)為探針的FISH與CLSM分析結(jié)果表明,Competibacter分布于整個(gè)污泥顆粒,但其代謝活性主要分布在顆粒表層100μm范圍內(nèi)。2.3好氧顆粒污泥內(nèi)pg-1菌株的分離和鑒定近年來(lái),國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者利用分子雜交技術(shù)對(duì)不同功能降解菌的生態(tài)變化進(jìn)行了一定研究,FISH技術(shù)的應(yīng)用克服了功能降解菌用常規(guī)方法培養(yǎng)困難的問(wèn)題。Jiangetal(2004)對(duì)SBR反應(yīng)器內(nèi)好氧顆粒污泥苯酚降解菌群分布進(jìn)行了研究,FISH-CLSM結(jié)果闡明好氧顆粒污泥內(nèi)PG-01菌株的豐度和空間分布,通過(guò)FITC標(biāo)記EUB338探針、TRITC標(biāo)記ARCH915探針和Cy5標(biāo)記Pand822探針在顆粒外表面20μm范圍內(nèi)的FISH結(jié)果表明,顆粒具有致密的外表面,內(nèi)部較為疏松,FISH結(jié)果表明顆粒完全由細(xì)菌細(xì)胞組成,與EUB338探針雜交的細(xì)菌分布與整個(gè)顆粒區(qū)域,通過(guò)ARCH915探針雜交未檢出古細(xì)菌,Pand822探針雜交表明顆粒內(nèi)部存在一定數(shù)量的PG-01球菌,多數(shù)PG-01細(xì)胞分布在顆粒的外表層,內(nèi)部有少量PG-01細(xì)胞存在。3環(huán)境微生物分子生物生態(tài)學(xué)的應(yīng)用及研究進(jìn)展盡管FISH技術(shù)應(yīng)用于環(huán)境微生物群落分子生態(tài)研究中還存在一些問(wèn)題,如熒光信號(hào)弱、分辨率不