光激化學(xué)發(fā)光免疫法檢測人血清胃蛋白酶原濃度

光激化學(xué)發(fā)光免疫法檢測人血清胃蛋白酶原濃度

胃蛋白酶（pg）是相對于胃蛋白酶的沒有活性前體，約為42kda。pg有七個(gè)合成酶。根據(jù)其生化免疫特性，可分為pg-a組和pg-a組。PGⅠ主要由胃底腺主細(xì)胞分泌，PGⅡ則由胃底腺、胃竇幽門腺、Brunner等腺分泌，它們可以反映胃黏膜狀態(tài)和功能。PG大多釋放入胃并活化為胃蛋白酶，僅有約1%通過黏膜毛細(xì)血管進(jìn)入血循環(huán)，當(dāng)胃部有病理變化時(shí)，如胃炎、胃潰瘍等，血清PG的水平會發(fā)生相應(yīng)的變化，PG作為胃病篩查的體外檢測已越來越受到關(guān)注。建立一種快速、靈敏的胃蛋白酶原測定方法是臨床研究人員關(guān)注的焦點(diǎn)。我們嘗試采用光激化學(xué)發(fā)光免疫分析方法(1ightinitiatedchemiluminescentassay,LICA)建立一種檢測胃蛋白酶原的方法，并對檢測性能進(jìn)行初步評價(jià)。1材料和方法1.1公司提供服務(wù)抗PGⅠ單克隆抗體8003#和8009#，抗PGⅡ單克隆抗體8101#和8103#均購自MedixBiochemia公司。發(fā)光微粒由博陽生物科技(上海)有限公司提供。LICA通用液系LICAHT光激化學(xué)發(fā)光檢測儀的配套試劑。二奎啉甲酸(BCATM)法蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒購自ThermoFisherScientific公司。相關(guān)性分析樣本，來自于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院住院及門診病人新鮮血液，分離血清冷凍保存。LICAHT高通量均相發(fā)光免疫分析儀、LICASP全自動(dòng)移液器由上海博陽醫(yī)療儀器有限公司提供；粒徑儀為NICOMP380激光衍射式粒度分布測量儀。96孔微孔板為LICAHT高通量均相發(fā)光免疫分析儀配套專用板。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1單克隆抗體w/w的制備依照參考文獻(xiàn)，取適量200nm左右表面為活性醛基的發(fā)光微粒2支，離心處理，超聲分散至0.1mol/L磷酸緩沖液(pH值7.0)中，以10∶2(W/w)的比例分別加入單克隆抗體8003#和8101#，分別加入適量三氫硼氰化鈉(NaCNBH3)催化，37℃旋轉(zhuǎn)混合反應(yīng)48h，進(jìn)行離心，清洗未反應(yīng)的單抗，之后將其分別定容至10mg/mL,4℃保存?zhèn)溆谩?.2.2生物素用量的確定取適量單克隆抗體8009#和8103#，將其溶液的pH值調(diào)整為8.5，以1∶30(摩爾比)的比例加入生物素(Biotin)，4℃混合反應(yīng)過夜，之后將未反應(yīng)的生物素進(jìn)行透析處理，將其定容至1mg/mL,4℃保存?zhèn)溆谩?.2.3血清系列稀釋將兩份經(jīng)AbbottArchitect系統(tǒng)定值的PGⅠ、PGⅡ混合樣本用分別小牛血清系列稀釋，配制成0、5、35、70、200、500ng/mL的PGI標(biāo)準(zhǔn)液和0、5、10、20、50、100ng/mL的PGⅡ標(biāo)準(zhǔn)液。再使用AbbotArchitect系統(tǒng)對每個(gè)稀釋液進(jìn)行標(biāo)定，標(biāo)定合格后，分裝成每管1mL，保存在-20℃?zhèn)溆谩?.2.4licaht光激化學(xué)發(fā)光探測法在96孔微孔板中，每孔依次加入標(biāo)準(zhǔn)品或者待測樣本25μL、免疫發(fā)光微粒試劑25μL、生物素標(biāo)記試劑25μL，將微孔板置于LICAHT光激化學(xué)發(fā)光檢測儀內(nèi)，儀器程序設(shè)定為37℃溫育1200s，然后儀器自動(dòng)加入LICA通用液175μL,37℃溫育900s后，讀取光信號RLU值。1.2.5檢測方法的性能評價(jià)1.2.5.同批試劑的分析靈敏度方法參考EP17-A程序：質(zhì)控在控的情況下，同批試劑一次運(yùn)行空白樣本或零值校準(zhǔn)品20次，計(jì)算均值及SD，以空白均值±2SD來計(jì)算方法的分析靈敏度。1.2.5.加標(biāo)回收率試驗(yàn)待測樣本等體積分為3份，取2份分別以等體積與高低質(zhì)控品（QCH和QCL）等體積混合，分別測定待測樣本、混合后樣本、QCH和QCL各測3次，取均值，計(jì)算回收率?；厥章?實(shí)際檢測濃度/理論濃度×100%。1.2.5.標(biāo)本重復(fù)測定參考EP5-A2程序：采用同一批試劑、校準(zhǔn)品，以各自配套的質(zhì)控血清作為測試標(biāo)本，一次運(yùn)行對標(biāo)本重復(fù)測定至少20次。計(jì)算均值、SD及CV。1.2.5.4.穩(wěn)定性37℃加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，將試劑在37℃存放7d，然后對其進(jìn)行物理檢查，并在線性、靈敏度、精密度方面考察其穩(wěn)定性。1.2.5.標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測值取65份患者血清樣本，分別用建立的LICA和AbbottArchitect試劑(化學(xué)發(fā)光法)進(jìn)行檢測，并對2種方法的檢測值進(jìn)行比較，得到相關(guān)性曲線。2結(jié)果2.1分析靈敏度光激化學(xué)發(fā)光法PGⅠ、PGⅡ試劑盒的分析靈敏度分別為0.8ng/mL和0.6ng/mL。2.2內(nèi)容度光激化學(xué)發(fā)光法PGⅠ、PGⅡ試劑盒QCL的批內(nèi)精密度分別為4.1%和4.3%，QCH的批內(nèi)精密度分別為0.93%和1.2%。2.3回收率的測定樣本與QCL等體積混合后的樣本為樣本1，與QCH等體積混合后的樣本為樣本2，回收率=實(shí)際檢測濃度/理論濃度×100%。結(jié)果見表1。2.4穩(wěn)定性將37℃存放7d的試劑取出，對其進(jìn)行物理檢查，并考察試劑的線性、靈敏度、精密度，結(jié)果見表2。2.5ypgii，4.分別用LICA法和Abbott化學(xué)發(fā)光法檢測65份患者血清樣本的PGⅠ和PGⅡ的濃度，相關(guān)結(jié)果見圖1和圖2，相關(guān)性方程分別為YPGI=1.004XPGI-0.147,r=0.977;YPGII=0.885XPGII+2.311,r=0.951；對二相關(guān)系數(shù)做統(tǒng)計(jì)分析，r>r0.05(63)，P<0.05，說明相關(guān)系數(shù)有統(tǒng)計(jì)意義。3本方法的優(yōu)缺點(diǎn)已有報(bào)道證實(shí)，血清胃蛋白酶原的水平可動(dòng)態(tài)地反映胃黏膜的狀態(tài)和組織功能：在發(fā)生基底腺黏膜萎縮性胃炎時(shí)，會伴隨著血清PGⅠ含量的顯著下降，PGⅠ/PGⅡ的比值降低，這提示了胃癌的可能；在胃潰瘍時(shí)，PGⅠ會異常增高；比較潰瘍組、慢性萎縮性胃炎組、胃癌組和正常組的PGⅠ值和PGⅠ/PGⅡ值，其大小順序如下：潰瘍組>正常組>萎縮性胃炎組>胃癌組。由于PGⅠ、PGⅡ檢測成本相對低廉且操作簡便，適合大批量的標(biāo)本檢測，對胃黏膜疾病的大規(guī)模篩查具有實(shí)用價(jià)值，因此可作為慢性萎縮性胃炎的胃黏膜萎縮程度篩查指征。對PG的檢測目前已經(jīng)報(bào)道的方法有免疫比濁分析、化學(xué)發(fā)光免疫分析、時(shí)間分辨熒光免疫分析等，但這些方法分別存在敏感性差、定量范圍窄、需要反復(fù)清洗與分離、檢測耗時(shí)長、自動(dòng)化程度不高等缺點(diǎn)。光激化學(xué)發(fā)光是繼LOCI（Luminescentoxygenchannelingimmunoassay）技術(shù)問世之后，在國內(nèi)建立、發(fā)展并應(yīng)用于臨床檢測的一種新型檢測技術(shù)。在均相條件下將內(nèi)部帶有染料的LICA通用液微粒以及包被有活性分子并且內(nèi)部帶有發(fā)光化合物的發(fā)光微?；旌衔锖蜋z測樣本混合。此時(shí)LICA通用液微粒和包被有活性分子的發(fā)光微粒可迅速有效地捕捉靶分子并形成免疫夾心復(fù)合物。經(jīng)680nm激發(fā)光照射后，LICA通用液微粒中的染料被誘導(dǎo)激活，并釋放高能態(tài)的單線態(tài)活性氧。該高能態(tài)的活性氧被近距離的發(fā)光微粒俘獲，傳遞能量以激活所述發(fā)光微粒中的發(fā)光化合物。數(shù)微秒后，發(fā)光微粒中的發(fā)光化合物將釋放出高能級610nm紅光，用光子計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)得到相對光量子單位(RLU)值。該法反應(yīng)為均相反應(yīng)，既可加快反應(yīng)速度，又可避免反復(fù)分離與清洗，同時(shí)，由于微粒表面積的增加，也提高了檢測的靈敏度。本研究采用LICA的雙抗體夾心法，建立了測定PGⅠ和PGⅡ的方法，并考察了分析性能。結(jié)果表明，LICA法測定PGI和PGII的本底低、靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性和重復(fù)性好、分析時(shí)間短(僅為25min)。在37℃7d的加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)中，試劑的外觀目測無沉淀，粒徑分布均一，在線性、靈敏度、精密度方面也和4度試劑無明顯差異，試劑的穩(wěn)定性佳。LICA測定PGⅠ和PGⅡ