光激化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清甲胎蛋白的實(shí)驗(yàn)性能評(píng)價(jià)

光激化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清甲胎蛋白的實(shí)驗(yàn)性能評(píng)價(jià)

自半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，臨床化學(xué)微量免疫分析技術(shù)經(jīng)歷了放射免疫分析、酶聯(lián)免疫分析和化學(xué)發(fā)光免疫分析的創(chuàng)新和質(zhì)的飛躍。上世紀(jì)90年代問(wèn)世的單線態(tài)氧分子能量傳遞發(fā)光免疫分析技術(shù)(luminescentoxygenchannelingimmunoassay,LOCI)具有均相、免清洗的技術(shù)特點(diǎn),同時(shí)具有高敏感性和特異性等檢測(cè)性能,應(yīng)用范圍涵蓋了常規(guī)臨床免疫分析、信號(hào)傳導(dǎo)、受體配體分析、基因檢測(cè)和新藥開(kāi)發(fā)等多個(gè)領(lǐng)域[1,2,3,4,5,6,7,8,9,10]。國(guó)內(nèi)研制成功了基于LOCI檢測(cè)原理的光激化學(xué)發(fā)光法(lightinitiatedchemiluminescenceassay,LICA)檢測(cè)設(shè)備和相關(guān)試劑。本研究擬對(duì)該方法檢測(cè)血清甲胎蛋白(AFP)實(shí)驗(yàn)性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。材料和方法一、藥品、試劑和儀器鏈霉親和素(SA)包被的感光珠(60mg/L,批號(hào)148)、生物素化抗AFP抗體(20mg/L,批號(hào)66)、抗AFP抗體包被發(fā)光珠(300mg/L,批號(hào)149)、AFP定標(biāo)品(0、6、22、122、480、1000μg/L,批號(hào)071211;標(biāo)準(zhǔn)參照物來(lái)源于中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)150542-0004)、質(zhì)控品(批號(hào)070829)、白色不透明微孔板(96孔和384孔)、光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀(LICAHT)。以上試劑和設(shè)備均由博陽(yáng)生物科技(上海)有限公司提供。實(shí)驗(yàn)用血清為上海市第六人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科留存的臨床患者檢測(cè)標(biāo)本。參比方法選用電化學(xué)發(fā)光免疫法AFP試劑及配套設(shè)備(Elecsys2010,Roche公司,德國(guó))。二、線性結(jié)合體的能量生物素化抗AFP抗體、發(fā)光珠上包被的抗AFP抗體、待測(cè)標(biāo)本或定標(biāo)品或質(zhì)控品中的抗原,三者形成雙抗體夾心結(jié)構(gòu),加入SA包被的感光珠后,形成感光珠-發(fā)光珠緊密連接。感光珠受680nm激光照射使周?chē)醴肿蛹ぐl(fā),變成單線態(tài)氧(singletoxygen,1ΔgO2,帶有1個(gè)激發(fā)態(tài)電子的氧分子),后者擴(kuò)散至發(fā)光珠并傳遞能量,發(fā)光珠發(fā)射520～620nm熒光信號(hào)并由發(fā)光檢測(cè)儀探測(cè)。此過(guò)程中,單線態(tài)氧半衰期僅4μs,在反應(yīng)體系中只能擴(kuò)散大約200nm。故只有結(jié)合態(tài)發(fā)光珠才能獲得單線態(tài)氧的能量而發(fā)光,非結(jié)合態(tài)發(fā)光珠由于相距較遠(yuǎn),無(wú)法獲得能量而不發(fā)光。發(fā)光信號(hào)強(qiáng)弱與夾心結(jié)構(gòu)中AFP的量呈正相關(guān),借助于定標(biāo)品建立相應(yīng)的函數(shù)關(guān)系,即可計(jì)算標(biāo)本和質(zhì)控品中AFP的濃度。三、光激化學(xué)發(fā)光儀待測(cè)標(biāo)本或定標(biāo)品或質(zhì)控品、抗AFP抗體包被發(fā)光珠、生物素化抗AFP抗體各15μL加入微孔板,放入光激化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀。儀器根據(jù)預(yù)先設(shè)定的程序進(jìn)行混勻,37℃溫育20min、加入SA包被感光珠60μL、37℃再溫育15min,680nm激光激發(fā)1s,延遲60ms后在520～620nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行光強(qiáng)度檢測(cè)1s,顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果等信息。四、實(shí)驗(yàn)的性能評(píng)價(jià)1.求平均相對(duì)光單位反求濃度rlu零濃度定標(biāo)品(小牛血清)重復(fù)測(cè)量5次,求平均相對(duì)光單位(RLU),按“xˉ+2sxˉ+2s”在標(biāo)準(zhǔn)曲線上反求濃度。共檢測(cè)2塊微孔板。2.平均批內(nèi)變異系數(shù)和總cv對(duì)低、高2個(gè)濃度質(zhì)控血清連續(xù)檢測(cè)11d,每天2批,每批各重復(fù)測(cè)量5次(其中1批重復(fù)10次),計(jì)算平均批內(nèi)變異系數(shù)(CV)和總CV。3.標(biāo)準(zhǔn)曲線及回收率高濃度AFP血清(936.1μg/L)用零濃度小牛血清作1∶20、1∶50、1∶80、1∶95、1∶99系列稀釋,各稀釋點(diǎn)重復(fù)測(cè)量2次,取平均值作圖,以各點(diǎn)實(shí)測(cè)平均濃度占期望值百分?jǐn)?shù)計(jì)算回收率。五、lica和lica檢測(cè)含AFP不同濃度的臨床檢測(cè)標(biāo)本358份,分別用Elecsys2010電化學(xué)發(fā)光免疫法和LICA進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)前者分析敏感性0.61μg/L,后者0.25μg/L,更小的數(shù)值則分別記為“<0.61μg/L”或“<0.25μg/L”,為了能夠進(jìn)行統(tǒng)計(jì)運(yùn)算,均按“0.61μg/L”(2例)或“0.25μg/L”(17例)計(jì)算。六、測(cè)量結(jié)果分析采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件,LICAAFP與Elecsys2010AFP測(cè)量值對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)和直線相關(guān)與回歸分析,對(duì)標(biāo)本陰、陽(yáng)性分組的一致性檢驗(yàn)采用McNemar檢驗(yàn)。結(jié)果一、檢測(cè)曲線擬合LICAAFP各點(diǎn)定標(biāo)品的發(fā)光值連續(xù)檢測(cè)11d,每天2次,共檢測(cè)22批次。曲線擬合采用3次樣條插值函數(shù),取均值后標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。圖中誤差棒代表“xˉ±2sxˉ±2s”。各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)總CV為4.96%～8.44%,r=0.999～1.000。二、實(shí)驗(yàn)的性能評(píng)價(jià)1.反求濃度及反求濃度2塊微孔板RLU的“xˉ+2sxˉ+2s”分別為1812和1922,反求濃度為0.22μg/L和0.27μg/L,平均值0.25μg/L。2.平均批內(nèi)cv2個(gè)質(zhì)控血清平均濃度分別為(10.69±0.43)μg/L和(499.97±15.85)μg/L。低值測(cè)量平均批內(nèi)CV3.2%(1.1%～6.9%),總CV4.1%;高值測(cè)量平均批內(nèi)CV1.8%(0.5%～3.2%),總CV3.2%。3.直線相關(guān)系數(shù)高濃度AFP血清系列稀釋曲線見(jiàn)圖2,直線相關(guān)系數(shù)(r)=-0.999(P<0.001),平均回收率為107.7%(97.4%～113.6%)。三、比較方法理論1.濃度的比較原始測(cè)量值不符合正態(tài)分布,取常用對(duì)數(shù)以后再進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn),結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.921,P=0.358)。2.gl的繪制散點(diǎn)圖將2種方法測(cè)量值取常用對(duì)數(shù)后[Elecsys2010(LogE)和LICA(LogL)]在直角坐標(biāo)系中繪制散點(diǎn)圖,見(jiàn)圖3。兩者具有明顯的直線相關(guān)趨勢(shì)(r=0.966,P<0.001);直線回歸方程為:LogE=0.233+0.737LogL(r2=0.933,方差分析F=4925.3,P<0.001,回歸方程成立)。3.種檢測(cè)方法對(duì)標(biāo)本結(jié)果的影響Elecsys2010AFP正常參考值為≤7μg/L,當(dāng)LICAAFP取正常參考值≤9μg/L時(shí),2種檢測(cè)方法對(duì)標(biāo)本的陰、陽(yáng)性分組結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.824)。只有20例(5.6%)分組不符,其中多數(shù)標(biāo)本2種方法測(cè)量值非常接近,見(jiàn)圖3的2、4象限散點(diǎn)(垂直線和水平線分別表示正常參考值的對(duì)數(shù)值:Log9和Log7),2種方法具有較好的一致性(Kappa=0.886,P<0.001)。檢測(cè)結(jié)果和干擾物檢測(cè)LICA檢測(cè)原理源于LOCI技術(shù),最初由Ullman等在1994年報(bào)道,后由PerkinElmer公司生產(chǎn)相關(guān)試劑(AlphaScreenTM)。該技術(shù)采用了納米級(jí)顆粒,這不僅大大增加了生物分子的包被面積,同時(shí)借助于SA-生物素放大系統(tǒng),使單位體積反應(yīng)體系中含有更高濃度的生物分子,為實(shí)現(xiàn)超高敏感性、減少標(biāo)本和試劑用量奠定了基礎(chǔ)。另外,這種納米顆粒在液相中保持穩(wěn)定的懸浮狀態(tài),并借助于“結(jié)合則發(fā)光”原理,實(shí)現(xiàn)了均相、免清洗檢測(cè)。Ullman等檢測(cè)促甲狀腺激素(TSH)的分析敏感性為1.9μU/L;批內(nèi)CV為3.1%～5.2%,與傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光法相關(guān)性好(r2>0.99)。Dafforn等將TSH標(biāo)本用量由常規(guī)的80μL減少至10nL,敏感性仍可達(dá)到2pmol/L,為實(shí)現(xiàn)高通量、多項(xiàng)目和小型化芯片檢測(cè)技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。該法對(duì)血清促絨毛膜性腺激素(HCG)的可測(cè)范圍為0.1～100000IU/L,與傳統(tǒng)化學(xué)發(fā)光法相關(guān)性好(r2=0.998)。檢測(cè)肌紅蛋白和肌鈣蛋白I也達(dá)到較高的敏感性和理想的精密度。本研究對(duì)AFP檢測(cè)結(jié)果顯示,LICA較Elecsys2010敏感性高(0.25與0.61μg/L),并具有優(yōu)越的精密度(總CV<5%)和良好的健全性(回收率97.4%～113.6%)。與Elecsys2010檢測(cè)方法平行對(duì)比研究顯示,兩者不但具有較高的相關(guān)性(r=0.966),而且其檢測(cè)濃度之間(P=0.358)及對(duì)標(biāo)本陰、陽(yáng)性分組(P=0.824)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表現(xiàn)為良好的一致性(Kappa=0.886)。本研究未對(duì)血清干擾物進(jìn)行研究。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,該方法對(duì)可能存在的干擾物質(zhì),如單線態(tài)氧淬滅物質(zhì)(抗氧化劑、血紅蛋白、維生素C等)、