銀杏多糖的提取及乙?；ㄈ〈鹊臏y(cè)定

銀杏多糖的提取及乙?；ㄈ〈鹊臏y(cè)定

根據(jù)現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)，白銀的生物活性主要與白銀糖有關(guān)。真菌多糖生物活性的發(fā)揮與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān),對(duì)多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾可能會(huì)使其具有一些新的理化性質(zhì)或生物活性,可作為研究多糖構(gòu)效關(guān)系的有效方法,是目前多糖研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。多糖結(jié)構(gòu)的化學(xué)修飾主要是利用多糖分子中的羥基、羧基、氨基等活性基團(tuán)進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)以引入新的基團(tuán),如硫酸基、磷酸基、羧甲基、烷基等。乙?；嗵堑囊阴；芨淖兌嗵欠肿拥亩ㄏ蛐院蜋M次序,從而改變多糖的物理性質(zhì),乙?；囊胧狗肿拥纳煺?fàn)顟B(tài)發(fā)生變化,導(dǎo)致多糖極性基團(tuán)暴露,增加在水中的溶解性,同時(shí)乙?；臄?shù)量和位置對(duì)多糖活性也有顯著影響。銀耳多糖乙?；揎椷€未見文獻(xiàn)報(bào)道,因此本文以乙酸酐作為?；噭?duì)銀耳多糖進(jìn)行化學(xué)修飾,研究建立了羥胺比色法測(cè)定乙?；y耳多糖取代度的方法,其研究結(jié)果將會(huì)為銀耳多糖進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系探討打下良好基礎(chǔ)。1材料和方法1.1試劑與儀器銀耳干品市售;苯酚、氫氧化鈉、濃鹽酸、鹽酸羥胺、六水三氯化鐵、醋酸鈉、三氯甲烷、正丁醇、濃硫酸、乙酸酐、無(wú)水乙醇國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?葡萄糖、氯化乙酰膽堿國(guó)產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)品;透析袋MW8000,美國(guó)聯(lián)合碳化。GL-21M型高速冷凍離心機(jī)湘儀;UV-1800型紫外分光光度計(jì)、UV-2802PC型紫外掃描儀尤尼柯;FD-1C-55型真空冷凍干機(jī)北京博醫(yī)康;FA2004B型電子天平上海天美;FZ102型微型植物試樣粉碎機(jī)北京中興偉業(yè)。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1水浸提取液制備銀耳子實(shí)體70~80℃干燥2h,粉碎并過(guò)60目篩。室溫條件下用乙醇(80%)攪拌浸泡銀耳粉末12h,減壓抽濾,濾餅用10倍體積70℃的水浸提5h,10000r/min冷凍離心10min,取上清液,并重復(fù)浸提1次。合并提取液,減壓濃縮,向殘余物中加入乙醇至終濃度80%,攪拌過(guò)夜,離心,收集沉淀,依次用無(wú)水乙醇、丙酮、乙醚依次充分洗滌,真空冷凍干燥,制得銀耳粗多糖。1.2.2銀耳多糖的檢測(cè)采用Sevage法除去銀耳多糖中的蛋白類雜質(zhì),向多糖水溶液中加入適量的Sevage試劑(三氯甲烷∶正丁醇=4∶1),劇烈振蕩30min,10000r/min冷凍離心10min,去除沉淀,取上清液,重復(fù)上述操作,紫外掃描檢測(cè),直至銀耳多糖溶液在260nm和280nm處無(wú)明顯吸收,表示其中的蛋白類雜質(zhì)已除盡。1.2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在105℃條件下干燥至恒重,精確稱取0.2000g,蒸餾水溶解并定容至100mL,溶液濃度為2mg/mL,分別量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mL置于50mL容量瓶中,并定容至刻度配制標(biāo)準(zhǔn)溶液,濃度分別為0.08,0.10,0.12,0.14,0.16,0.18,0.20mg/mL。將50mL濃硫酸緩緩加入10mL水中冷卻至室溫,加入0.6g苯酚晶體攪拌使其溶解配成顯色液。取1.00mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測(cè)試樣溶液置于試管中,加入5.00mL顯色液,振蕩混勻。置于沸水浴中保溫30min,取出,放在冷水浴中,冷卻至室溫,于490nm處測(cè)定其吸光度值。1.2.4控制反應(yīng)ph取0.50g銀耳多糖溶解于10mL水中,用3%氫氧化鈉調(diào)pH至11.0。室溫條件下交替加入氫氧化鈉溶液和乙酸酐,使反應(yīng)溶液的pH控制在7.0~11.0范圍內(nèi),直至3.0mL乙酸酐加完,25~30℃下反應(yīng)液維持pH為8.0攪拌反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后,用1.0mol/L鹽酸中和反應(yīng)溶液至pH=7.0,將反應(yīng)液置于透析袋中,第1、2d自來(lái)水透析,第3d蒸餾水透析,3d后取出將內(nèi)液減壓蒸餾至小體積,加入少量蒸餾水溶解后進(jìn)行真空冷凍干燥,研磨,得到乙?；y耳多糖。1.2.5乙?；〈鹊臏y(cè)定1.2.5.藥品及其他總氮酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液A:鹽酸羥胺溶液(2mol/L)取鹽酸羥胺13.9g,加水定容至100mL,冷藏保存;B:氫氧化鈉溶液(3.5mol/L):稱取氫氧化鈉14.0g,加水定容至100mL;C:鹽酸溶液(4.0mol/L):取濃鹽酸33.3mL,加水定容至100mL;D:三氯化鐵-鹽酸溶液(0.37mol/L):稱取FeCl3·6H2O10.0g,加0.1mol/L鹽酸溶液定容至100mL;E:堿性羥胺溶液:將等體積的鹽酸羥胺溶液與氫氧化鈉混合配制,現(xiàn)配現(xiàn)用;F:醋酸鈉溶液(0.001mol/L):稱取醋酸鈉0.0205g配制成250mL溶液;G:氯化乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液:精確稱取氯化乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品53.2mg,置于50mL容量瓶中,加0.001mol/L醋酸鈉溶液溶解,定容,現(xiàn)配現(xiàn)用;H:樣品溶液(0.218mg/mL):稱取乙?；y耳多糖54.5mg,置于50mL容量瓶中,加0.001mol/L醋酸鈉溶液溶解,定容。1.2.5.2.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備1.2.5.乙?；y耳多糖的取代度根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到乙?；y耳多糖的乙?；縈1,按公式(1)先計(jì)算出乙酰化銀耳多糖中乙?；陌俜趾縒,再根據(jù)公式(2)計(jì)算乙?；y耳多糖的取代度。式中,M1-乙?；y耳多糖中乙?；馁|(zhì)量(mg);M2-乙?；y耳多糖的質(zhì)量(mg);162-多糖每個(gè)糖單元相對(duì)分子質(zhì)量;43-乙?；鄬?duì)分子質(zhì)量;1-氫原子的相對(duì)原子質(zhì)量。2結(jié)果與分析2.1銀耳多糖的純化銀耳多糖經(jīng)Sevage試劑重復(fù)操作8次后的紫外掃描圖譜見圖1,在260nm和280nm處無(wú)明顯吸收,表明純化得到的銀耳多糖中已基本除去蛋白類雜質(zhì)。然后經(jīng)80%乙醇析出沉淀,真空冷凍干燥得銀耳多糖,提取率為9.1%。2.2sevage試劑純化的銀耳多糖的制備硫酸苯酚法測(cè)定銀耳多糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2,回歸方程為y=1.3821x+0.0168,R2=0.9965,在葡萄糖濃度0.08~0.2mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,測(cè)得經(jīng)Sevage試劑純化的銀耳多糖含量為80.03%。2.3y.0.4.4.3氯化乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)品乙?；鶟舛扰c其吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3,回歸方程為y=0.0118x+0.0036,R2=0.9991。在測(cè)定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,根據(jù)回歸方程計(jì)算得乙?；y耳多糖乙?；鶟舛葹?1.75μg/mL,計(jì)算其取代度為0.214。3乙?；y耳多糖結(jié)構(gòu)解析及活性研究以水提醇沉法制備的銀耳多糖經(jīng)Sevage試劑處理8次得到較好的純化效果,硫酸苯酚法測(cè)定其含量為80.03%,雖然該法對(duì)銀耳多糖純化效率較低但仍然是目前去除蛋白類雜質(zhì)的常用方法,銀耳多糖的提取率為9.1%。多糖在酸催化下進(jìn)行酯化反應(yīng)往往會(huì)伴隨著多糖鏈的降解,為了抑制多糖鏈的降解過(guò)程可以選擇在堿性條件下完成酯化反應(yīng);因此本文選擇在氫氧化鈉水溶液的均相體系中以乙酸酐為?；噭?duì)銀耳多糖進(jìn)行乙?；揎?為了避免生成的酯在堿性條件下水解需要及時(shí)調(diào)整反應(yīng)液的pH,在本實(shí)驗(yàn)條件下獲得了低取代度的乙?；y耳多糖(DS=0.214)。乙?；嗵巧锘钚圆粌H受到乙?；鶖?shù)量的影響,還與取代的位置相關(guān),O-3位具有乙?；鶗r(shí),多糖抗腫瘤活性最強(qiáng);O-5位具有乙?；鶗r(shí),抗腫瘤活性顯著減弱;當(dāng)O位全部乙酰化時(shí),活性消失。因此對(duì)乙?；y耳多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析以及相應(yīng)的生物活性研究將成為我們后續(xù)研究的方向。精確移取氯化乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL,分別置于試管中,加水補(bǔ)足至1mL,加2mL新鮮配制的堿性羥胺溶液,搖勻,于室溫中放置4min,加1mL4mol/L鹽酸,使得pH=1.2±0.