人促黃體生成素光激化學(xué)發(fā)光免疫分析

人促黃體生成素光激化學(xué)發(fā)光免疫分析

人體激素（hlh）是對(duì)垂體前葉嗜堿性細(xì)胞的激素。這是一種白色糖蛋白，相對(duì)分子量為3000左右。hLH分子由兩條非共價(jià)連接的不同肽鏈(α和β)組成,α鏈與人促甲狀腺激素(hTSH)、人促卵泡激素(hFSH)及人絨毛膜促性腺激素(hCG)相似,但β鏈的氨基酸順序和組成不同,使其具有特異性,決定hLH的生物活性。在有卵泡刺激素存在下,與其協(xié)同作用,刺激卵巢雌激素分泌,使卵泡成熟與排卵,使破裂卵泡形成黃體并分泌雌激素和孕激素;對(duì)于男性主要是促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞增生,促進(jìn)睪酮的合成與分泌。在健康月經(jīng)周期女性中,hLH濃度變化受排卵周期的影響,因此測(cè)定血清中hLH濃度可以預(yù)測(cè)女性排卵狀況。此外,hLH的濃度變化和體內(nèi)很多疾病的發(fā)生也有直接的聯(lián)系,定量檢測(cè)出血清中hLH的濃度對(duì)臨床疾病的診斷有重要意義。目前廣泛應(yīng)用于臨床的是傳統(tǒng)的非均相免疫分析(如ELISA、時(shí)間分辨熒光免疫分析),需要通過洗滌來分離結(jié)合標(biāo)記與游離標(biāo)記,存在操作過程步驟多,不易標(biāo)準(zhǔn)化及自動(dòng)化等缺點(diǎn)。本研究采用光激化學(xué)發(fā)光免疫分析(AlphaLISA)技術(shù)研制hLH定量檢測(cè)試劑,評(píng)價(jià)各項(xiàng)性能指標(biāo),并與其它檢測(cè)試劑盒進(jìn)行比較,評(píng)價(jià)其在臨床檢測(cè)應(yīng)用中的可行性。1材料和方法1.1生物素和試劑2株配對(duì)hLH單克隆抗體為芬蘭Medix公司產(chǎn)品;hLH抗原購(gòu)自美國(guó)Biodesign公司;生物素購(gòu)自Sigma公司;受體微球、鏈霉親和素化的供體微球?yàn)槊绹?guó)PerkinElmer公司產(chǎn)品;96孔微孔板為美國(guó)PerkinElmer公司產(chǎn)品;檢測(cè)儀為美國(guó)PerkinElmer公司的2300EnSpireTM檢測(cè)儀。158份血清樣本來自南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1稀釋液的制備稀釋hLH抗原至濃度分別為0、0.55、2.2、11、66、135U/L系列濃度,稀釋液為含50mmol/LTris-HCl,1.5%BSA、0.9%NaCl、0.05%NaN3、0.01%Tween-20,pH7.8的反應(yīng)緩沖液。1.2.2體外抗體反應(yīng)時(shí)間的合成將0.2mghLH抗體加入Millipore公司的帶有濾膜的離心管中,以9000r/min離心8min,用緩沖液(pH6.2、0.05mol/LMES溶液)重復(fù)洗滌6次后收集抗體,在抗體溶液中加入1mg受體微球、10μl25mg/mlNaBH3CN(用緩沖液配制,現(xiàn)配現(xiàn)用)、1.25μl10%Tween-20,而后用緩沖液將體積補(bǔ)充到200μl,37℃避光振蕩反應(yīng)48h。最后加入10μl65mg/mlCMO(用0.8mol/LNaOH配制,現(xiàn)配現(xiàn)用)37℃避光孵育1h封閉未結(jié)合位點(diǎn),離心洗滌,得到已連接抗體的受體微球,調(diào)整受體微球濃度為5mg/ml。1.2.3抗體溶液的配制將0.5mg抗體加入到Millipore公司帶有濾膜的離心管中,以9000r/min離心8min,每次用200μl緩沖液(0.1mol/LNa2CO3/NaHCO3,pH9.5),重復(fù)洗滌6次后收集抗體,調(diào)整抗體濃度為20mg/ml。在抗體溶液中加入2μl22mg/ml生物素(用DMSO配制,現(xiàn)配現(xiàn)用),室溫振動(dòng)孵育4h。利用PBS(pH7.4)4℃透析24h,每6h換液1次,收集透析袋中液體,并將其抗體濃度調(diào)整為0.5mg/ml。1.2.4檢測(cè)信號(hào)值的測(cè)定將25μl標(biāo)準(zhǔn)品或待檢測(cè)樣品加入微孔板中,并分別加入以分析緩沖液1∶50比例稀釋的已連接抗體的受體微球25μl、1∶100比例稀釋的生物素化抗體25μl,37℃振動(dòng)孵育15min,然后在避光條件下加入鏈霉親和素化的供體微球175μl,37℃振動(dòng)孵育15min后在2300EnSpireTM檢測(cè)儀上檢測(cè)信號(hào)值。1.3統(tǒng)計(jì)處理2結(jié)果2.1hlh試劑盒劑量-反應(yīng)曲線線性相關(guān)系數(shù)以自制試劑中參考標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),信號(hào)值計(jì)數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),由雙對(duì)數(shù)數(shù)學(xué)模型Log-Log函數(shù)處理,測(cè)得hLH試劑盒劑量-反應(yīng)曲線線性相關(guān)系數(shù)為r=0.998(圖1),表明自制試劑有良好的劑量反應(yīng)。2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的分析靈敏度以零參考標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定值(n=20)的均值加上2倍的標(biāo)準(zhǔn)差后得到信號(hào)值,將其代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算所得為分析靈敏度,其值為0.164U/L。2.3研究對(duì)象含200U/LhFSH、324mU/LhTSH和2000U/LhCG標(biāo)本在本試劑的測(cè)定值分別為1.05、1.24和3.45U/L。2.4試驗(yàn)區(qū)域自制hLH光激化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑劑量-反應(yīng)曲線的范圍為0.164～135U/L。2.5價(jià)格精度以hLH國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照品,自制試劑檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的偏差值均在0.900～1.100之間(表1),準(zhǔn)確度良好。2.6測(cè)定條件60u/l采用自制的低、中、高3個(gè)hLH質(zhì)控品(質(zhì)控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ,預(yù)期濃度分別為5、20、60U/L)進(jìn)行測(cè)定。由表2可見,自制試劑的分析內(nèi)(同一實(shí)驗(yàn)內(nèi)同一樣本重復(fù)測(cè)定)和分析間(同一試劑,不同批次之間)變異系數(shù)分別為4.3%～6.1%和7.4%～8.1%,符合體外診斷試劑檢定結(jié)果的變異系數(shù)(CV%)應(yīng)不高于10.0%的要求。2.7血清回收率及基質(zhì)物干擾試驗(yàn)向5個(gè)已知濃度的hLH血清樣本中添加不同濃度的hLH純抗原,使得血清中hLH的最終期望濃度為100U/L,計(jì)算回收率,hLH的回收率在93.7%～105.9%之間,表明添加物與血清待測(cè)物一致,基本沒有血清基質(zhì)物的干擾(表3)。2.8光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑反應(yīng)變化的檢測(cè)向已知濃度的血清樣本中分別添加血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素干擾物,比較測(cè)定濃度值和原始濃度值,結(jié)果表明自制hLH光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑在檢測(cè)標(biāo)本時(shí)基本不受血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素的干擾(表4)。2.9陽性符合率和陰性符合率陰、陽性血清標(biāo)本各50份,分別用自制hLH光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑(AlphaLISA)和羅氏電化學(xué)發(fā)光(ECLIA)診斷試劑盒進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果顯示,兩種診斷試劑的陽性符合率和陰性符合率均為100%。158份臨床血樣同時(shí)用自制試劑與ECLIA進(jìn)行平行檢測(cè),對(duì)所測(cè)數(shù)值進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)分析,結(jié)果顯示兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.468,P=0.07)。通過比較常用方法的檢測(cè)性能(表5),可以看出自制光激化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑在檢測(cè)性能指標(biāo)上與電化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒、時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑盒無明顯差異。3光激化學(xué)發(fā)光免疫分析法hLH作為一種內(nèi)分泌激素,它在血清中的含量變化反應(yīng)了體內(nèi)很多生理和病理狀態(tài)。其中hLH升高常見于多囊卵巢綜合征、先天性卵巢發(fā)育不全、先天性睪丸發(fā)育不良(不孕)、Turner綜合征、卵巢功能早衰及卵巢切除后。hLH降低則常見于腺垂體功能下降、黃體功能不全、長(zhǎng)期服用避孕藥等,不孕癥患者血清hLH濃度極低。因此準(zhǔn)確測(cè)定血清中hLH含量可以作為檢測(cè)疾病的根據(jù)以及進(jìn)行療效跟蹤。另外hLH還可用于確定排卵時(shí)間、絕經(jīng)期、監(jiān)控內(nèi)分泌治療等。目前臨床檢測(cè)方法有放射免疫法(RIA)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)、時(shí)間分辨(TRFIA)熒光免疫法和化學(xué)發(fā)光免疫法(CLIA)。但它們都有各自的缺點(diǎn),RIA有放射性污染,且半衰期和試劑有效期短;ELISA只能定性,靈敏度低及線性范圍窄;CLIA不可反復(fù)測(cè)量,本底高,易受外界溫度,pH值的影響;TRFIA操作繁瑣,需要不斷的分離和洗滌。光激化學(xué)發(fā)光免疫分析法是一種通過化學(xué)發(fā)光檢測(cè)微球間的結(jié)合,進(jìn)而檢測(cè)分析物含量的方法。在680nm的光照下,供體微球中的光敏物質(zhì)受到激發(fā)產(chǎn)生單線態(tài)氧,單線態(tài)氧擴(kuò)散至受體微球,與其中的發(fā)光物質(zhì)反應(yīng)后產(chǎn)生615nm的化學(xué)發(fā)光。由于單線態(tài)氧在溶液中維持活性的時(shí)間很短(約4μs),只能擴(kuò)散約200nm的距離,因此只有那些通過待測(cè)物質(zhì)連接在一起的受體微球和供體微球才能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了均相免疫測(cè)定,避免了以往非均相檢測(cè)方法中的分離和洗滌過程,操作過程簡(jiǎn)便,易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化及規(guī)模化檢測(cè),操作時(shí)間也短,可在35min完成,且整個(gè)操作過程不易受pH值、溫度等外界因素的干擾,保證了檢測(cè)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。此外,還具有靈敏度高、線性范圍寬、特異性強(qiáng)、時(shí)間分辨能力強(qiáng)、上樣量少(低至5μl)、價(jià)格低等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)運(yùn)用廣泛,已涵蓋蛋白質(zhì)、多肽激素、酶活性、核苷酸等眾多領(lǐng)域。本文旨在應(yīng)用光激化學(xué)發(fā)光免疫分析法來定量檢測(cè)人血清中hLH的含量,對(duì)于參考標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)定,與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品的比值均在范圍之內(nèi)(0.9～1.1),說明檢測(cè)標(biāo)本的濃度值是可信的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,其分析靈敏度為0.164U/L,較現(xiàn)有的一些檢測(cè)分析方法靈敏度皆高,這樣有利于提高檢出率,縮短窗口期。線性范圍為0.164～135U/L,最高檢出量有點(diǎn)偏低,但是血清中hLH濃度值大于135U/L的病例很少,為此不影響臨床實(shí)際運(yùn)用。精密度實(shí)驗(yàn)顯示,自制試劑分析內(nèi)和分析間變異系數(shù)均低于10%,表明該系統(tǒng)的精密度較高。特異性結(jié)果顯示,與hTSH、hFSH和hCG無明顯交叉反應(yīng),可見采用的兩株單克隆抗體特異性好。158份臨床血清樣本用本試劑與羅氏電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒平行檢測(cè),對(duì)所測(cè)數(shù)值采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析,結(jié)果顯