雙黃連粉針劑及其提取物的血漿藥物化學研究

雙黃連粉針劑及其提取物的血漿藥物化學研究

雙黃連粉劑由蜂蜜、連翹和黃鼠尾提取物制成。具有強烈的抗菌和抗癌作用。常用于病毒性肺炎、上呼吸道感染等病毒和細菌感染疾病的治療。然而，近年來，該注射劑的副作用引起了許多醫(yī)生的關注。本實驗旨在通過研究比較雙黃連粉針劑給予大鼠灌胃后入血化學成分的變化,為闡明雙黃連粉針劑體內藥效物質基礎,進一步優(yōu)化雙黃連粉針劑的處方提供實驗依據。1材料表面1.1對照品的制備黃芩苷(批號715-9003)、綠原酸(批號110753-200212)、連翹苷(批號0821-9903)、黃芩素(批號111595-200301)等對照品購自中國藥品生物制品檢定所;甲醇、乙腈為色譜純(FisherCompany,Inc.美國),水為超純水,其他試劑均為市售分析純。雙黃連粉針劑(處方中金銀花、連翹及黃芩等藥材的比例為1∶2∶1)及金銀花、連翹、黃芩提取物均由哈藥集團中藥二廠提供。1.2動物清潔級SD系雄性大鼠,體重250~300g,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,合格證號SCXK(京)2002.003。1.3洗脫系統(tǒng)及色譜美國Angilent1100高效液相色譜儀,包括四元梯度洗脫系統(tǒng),DAD檢測器,Angilent色譜工作站;CleanertSPEODS-C18固相萃取小柱(美國艾杰爾科技公司)。2方法2.1對照品溶液的制備精密稱取綠原酸、連翹苷、黃芩苷、黃芩素對照品適量,加甲醇溶解并制備成含上述對照品0.044,0.19,0.04,0.01mg·mL-1的混合標準品溶液,過0.22μm微孔濾膜,即得。2.2加甲醇法提取其他樣品分別精密稱取雙黃連粉針劑和各單味藥提取物適量,加甲醇分別制成含上述各樣品1.067,3.0,0.121,1.067mg·mL-1的溶液,過0.22μm微孔濾膜,即得。2.3檸不同給藥量的制備取雄性SD系大鼠,禁食12h,但自由飲水,灌胃給予雙黃連粉針劑及各單味藥提取物的供試液3mL(2.16g·250g-1),腹腔注射20%烏拉坦生理鹽水溶液(1.8g·kg-1)麻醉,做頸動脈插管,分別于給藥后15,30,60,90,120,180,240min取血0.5mL,用3.8%檸檬酸鈉抗凝(血液與檸檬酸鈉溶液的比例是9∶1),4000r·min-1離心10min,分取血漿,用0.1mol·L-1鹽酸調pH3~4,加于SPE固相萃取小柱上,先用0.5mL水洗脫,棄去洗脫液,再用2%(pH4)酸性甲醇10mL洗脫,收集洗脫液,低溫揮干,殘渣用300μL甲醇復溶,以0.22μm微孔濾膜濾過,即得。精密吸取20μL供HPLC測定。2.4u3000酸、流速及洗脫程序迪馬公司C18鉆石色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);梯度洗脫,流動相A為乙腈,B為1%醋酸,流速1mL·min-1;梯度洗脫程序:0~20min,A15%~20%;20~32min,A20%~37%;32~40min,A37%~40%;40~50min,A40%~50%;50~60min,A50%~15%。柱溫25℃;波長采集范圍190~400nm;檢測波長280nm。2.5回血成分及來源檢測取雙黃連粉針劑及各單味藥提取物的供試品溶液、對照品液、雙黃連粉針劑及各單味藥提取物的血漿以及空白血漿樣品在相同色譜條件下進行HPLC分析,建立HPLC色譜圖,比較確定入血成分及其來源。上述3種藥材提取物與雙黃連粉針劑譜峰相關性的研究:按照文獻報道方法分別求算雙黃連粉針劑與上述3種藥材提取物指紋圖中相匹配譜峰保留時間的相對標準偏差,說明兩峰之間的相關性。3灌胃后不同時間的血漿hplc分析大鼠灌胃雙黃連粉針劑90min后,血漿HPLC圖譜中可見8個主要成分;其中1,2,3,5,7,8號峰為雙黃連粉針劑中原形成分,而4,6號峰為新出現(xiàn)的代謝產物。經與各提取物進行比對,1號峰為綠原酸,5號峰為黃芩苷,8號峰為黃芩素。與雙黃連原液的HPLC圖譜比較,雙黃連粉針劑90min后的HPLC指紋圖譜可見2號峰的峰面積的相對比例明顯增大,而5號峰面積明顯減小。通過對4,6號峰的DAD光譜檢測分析發(fā)現(xiàn),其與黃芩苷的光譜極為相似,疑為黃芩苷的代謝物。未發(fā)現(xiàn)連翹的幾個主要成分(包括9號峰的連翹苷)有明顯的入血吸收(圖1)。金銀花、連翹、黃芩提取物大鼠灌胃后不同時間的血漿HPLC指紋圖譜見圖2~4。金銀花提取物灌胃給藥30min后(圖2)可檢測出綠原酸(1號峰),同時還出現(xiàn)了金銀花提取物中沒有的新成分,即5~8號峰;60min后(圖2)又出現(xiàn)了1個金銀花提取物中的原形成分(4號峰),而6,7號峰面積減小,8號峰面積明顯增高;90min后(圖2)未見綠原酸及6,7號峰的相對峰面積發(fā)生較大變化,而5號峰的相對面積明顯增大,8號峰面積變小。連翹提取物大鼠灌胃給藥后,各時間點均未檢測到連翹苷。有文獻報道證明,連翹苷在體內無論單獨給藥或與其他吸收促進劑一起給藥,在胃、小腸及結腸均不被吸收。但本實驗中發(fā)現(xiàn)連翹提取物中其他成分有少量入血,同時出現(xiàn)了2個新成分(圖3)。黃芩提取物大鼠灌胃后在測定的240min(圖4)內黃芩苷的吸收呈現(xiàn)了雙峰現(xiàn)象,并且在240min時達到峰值,與文獻報道的黃芩苷吸收存在肝腸循環(huán)相符。HPLC譜圖中的2號峰經采用標準加入法確認其為黃芩素。通過比較口服黃芩提取物及雙黃連粉針劑發(fā)現(xiàn)黃芩苷在口服雙黃連粉針劑時的降解速度大于黃芩提取物,這與狄斌等人的研究結果相一致。本項研究發(fā)現(xiàn)大鼠灌胃給予雙黃連粉針劑后在血漿中檢測不到連翹苷,可以檢測到微量綠原酸,但更多的是其代謝產物。據國外文獻報道,大鼠灌胃綠原酸體內吸收較差,生物利用度不足1%。主要原因是綠原酸很容易受到腸道菌群和腸壁代謝酶的作用,綠原酸的代謝產物主要為咖啡酸、奎尼酸,上述兩種產物可繼續(xù)代謝為馬尿酸、安息香酸、阿魏酸和異阿魏